[发明专利]一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物与生物技术领域，具体涉及一种用于研究醋糟无土栽培基质中微生物群落结构的总DNA提取方法。

背景技术

微生物是无土栽培基质中非常重要的组成部分，因而对无土栽培基质中微生物的研究是无土栽培基质研究领域内一个重要的方向，对于促进无土基质栽培的发展具有十分重要的意义。常用的用于微生物群落研究的方法有：培养分离法、磷脂脂肪酸法和BIOLOG板法等，但是上述方法都有各自的缺陷。培养分离法只适合可培养微生物的研究，由于环境中的微生物99%以上都是不可培养的，因而传统培养分离法大大限制了对微生物资源的研究。磷脂脂肪酸法所依赖的针对个别脂肪酸标识物的细致描述也是源于少数可被分离的微生物的纯培养。因此，在研究无法培养的菌群占绝大多数的微生物群落时，磷脂脂肪酸法也存在一定的局限性。另外，由于不同菌种相同脂肪酸的相互叠加，磷脂脂肪酸法也难于在种水平上辩明微生物群落的确切组成。不同的微生物对同一C源的利用能力不同，微生物对不同单一C源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，BIOLOG板法也不能准确的反应出环境中的微生物群落结构的差异。

随着分子生物学的发展，利用16S (18S) rRNA/rDNA 序列分析技术，研究者可以在不对微生物进行纯培养的情况下对环境中的微生物进行全面的研究，包括微生物的分离鉴定、群落结构和功能的分析。而利用分子生物学的手段对环境中的微生物进行研究，获得高产量和高质量的DNA是应用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技术进行环境微生物分子生态学研究的基础，常用的用于土壤和堆肥DNA提取的方法有：液氮研磨法，SDS-反复冻融法、玻璃珠吸附法等。

醋糟基质是以制醋过程中产生的残渣醋糟为原料，通过堆制发酵形成的新型园艺有机基质，作为草炭的替代基质，醋糟基质在育苗和栽培中已经得到广泛使用，并投入了商品化生产。但目前对醋糟无土栽培基质中微生物群落结构的变化尚不清楚。利用16S (18S) rRNA/rDNA 序列分析技术可解决这方面的问题。醋糟基质作为一种堆肥产品，在堆制发酵的过程中会产生大量的腐殖酸，这些腐殖酸会对DNA的提取及PCR扩增产生强烈的影响。对腐殖酸的去除，常用的方法有：硫酸铝捕获腐殖酸法、氯化铯密度梯度离心法，高效分子量排阻层析，试剂盒纯化法。这些纯化处理方法增加了复杂性，且费时费力。因而寻求一种有效的获取高质量的DNA提取方法是利用分子生物学手段研究醋糟基质栽培过程中微生物群落结构变化所急需解决的问题。

发明内容

本发明针对醋糟基质含有大量腐殖酸这一特点，对传统的土壤微生物基因组DNA提取方法进行了改进，通过在DNA提取buffer中添加0.5% 的β-巯基乙醇和0.5% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对醋糟基质中的腐殖酸和酚类物质进行了初步去除。用氯仿: 异戊醇(24: 1/v: v) 抽提蛋白后，用2% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对DNA中的腐殖酸和酚类物质再次进行去除。从而建立了一种高效、快速的可用于16S (18S) rDNA PCR扩增的高质量的醋糟基质总DNA提取方法。为利用分子生物学的手段研究醋糟基质中微生物的群落结构奠定了基础。

本发明的技术方案如下：

一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）先在醋糟基质中加入DNA提取缓冲液和蛋白酶K，振摇，使醋糟基质中的微生物充分悬浮在DNA提取缓冲液中，优选DNA提取缓冲液的配方为：10 mM Tris-Hcl (pH 8.0)，100 mM Sodium EDTA(pH 8.0)，100 mM Sodium phosphate (pH 8.0)，1.5 M Nacl， 1% CTAB，0.5% β-巯基乙醇和0.5% PVP，优选蛋白酶K用量为蛋白酶K的浓度为20 mg/ ml，加入量为12.5 μl；

（2）将步骤(1)制得的悬浮液用十二烷基磺酸钠裂解醋糟基质中的微生物，离心后取上清，优选十二烷基磺酸钠的质量分数为20%；

(3) 加入与步骤(2)取得的上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿:异戊醇体积比=24: 1，离心后取上清；

(4) 加入与步骤(3)取得的上清液等体积的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚类物质，离心后取上清，优选聚乙烯聚吡咯烷酮的质量分数为2%；

 (5) 将装有步骤(4)中取得的上清液的离心管上下轻微的摇动，直至离心管中可见絮状物质，将离心管置于-20 ℃沉淀 20 min；