[发明专利]一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于：所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中：

所述第一试剂为含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体、pH为7~9的缓冲液，所述荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为0.5~1μg/mL；  

所述第二试剂为含有碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、pH为7~9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL；

所述磁分离试剂为包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

2.根据权利要求1所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原由碱性磷酸酶与游离三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。

3.根据权利要求1所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，其特征在于：所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒中，抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。

4.一种如权利要求1~3中任一项权利要求所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其特征在于：所述第二试剂的制备过程如下：

① 使游离三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2~8℃下保存备用；

② 将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.1~1.3混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择适当的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为0.5~1.5mg/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的pH为9~10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的磁分离试剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与抗荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2~18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2μm，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的抗荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万；所述的偶联剂为碳二亚胺。

9.一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其特征在于：所述的免疫反应步骤采用权利要求1~3中任一项权利要求所述的试剂盒，且具体实施如下：在检测样管中加入待测样本原液或稀释液，然后依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25~40℃下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25~40℃下进行第二次温育；

所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。

10.根据权利要求9所述的游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定方法，其特征在于： 所述第一次温育的时间为10~20min；第二次温育的时间为3~15min。