[发明专利]一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括用于免疫反应步骤的免疫反应试剂，所述的免疫反应试剂包括含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液和包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，其特征在于：所述的免疫反应试剂还包括含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液，该碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与游离甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。

2.根据权利要求1所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的pH为7~9，其中的荧光素标记的游离甲状腺抗体的浓度为0.5~1μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒中，抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。

4.根据权利要求1或2所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的pH为7~9，其中碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL。

5.一种如权利要求1~4中任一项权利要求所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液以及所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于：所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的制备过程如下：

① 使游离甲状腺素抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2~8℃下保存备用，其中：所述的游离甲状腺素抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg；

② 将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.1~1.3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为0.5~1.5mg/mL。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，取游离甲状腺素抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为20~50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应2~3小时，用二甲基亚砜将反应液1:10稀释，于2~8℃下保存备用。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：步骤②中，取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液，用pH 9~10的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5~1.5mg/mL，加入步骤①所得反应液，室温静置反应20~60min。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与抗游离甲状腺素抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与抗游离甲状腺素抗体的pH为9~10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的抗游离甲状腺素抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与抗荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2~18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得，其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2μm，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的抗荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。

10.根据权利要求5或8或9所述的制备方法，其特征在于：所述的具有适当pH值的缓冲液为含有0.5%牛血清白蛋白、pH8.0的TRIS缓冲液。