[发明专利]一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和纳米磁微粒化学发光测定技术的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法。本发明还特别涉及该试剂盒的制备方法。 

背景技术

甲状腺素，即3,5,3',5'-四碘甲状腺原氨酸(T4)是一种分子量为777的甲状腺激素。T4在循环中有结合态和游离态两种形式，正常情况下两种形式之间保持着动态平衡。循环中T4有75%与甲状腺结合球蛋白（TBG）结合，15%与前白蛋白，10%与白蛋白结合。游离T4(FT4)仅占0.03%，却发挥着真正的生理作用。妊娠期、肝炎、先天性TBG增高、服用雌激素(口服避孕药)等引起TBG浓度增高时，总T3、T4的浓度也随之升高。肾病、肝功能衰竭、先天性TBG缺乏、服用雄激素或大剂量糖皮质激素引起TBG浓度降低时，总T3、T4的浓度也随之降低。这些情况下测定总T3、T4不能准确反映甲状腺的功能状态。游离T3、游离T4的水平受到影响程度较小，因此很多情况下测定游离态的甲状腺激素能更好的了解甲状腺功能。 

FT4是目前医院开展的常规免疫检测项目，对甲状腺疾病的诊断有无可替代的重要参考价值。目前我国已批准上市的FT4免疫检测试剂有进口和国产两大类，其中进口试剂有雅培等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光，而国产试剂中采用的方法学多数为放免法，近两年开始出现化学发光类产品。 

放免分析法存在线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。而纳米磁微粒化学发光测定法具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前纳米磁微粒化学发光测定技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。 

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶 联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。 

中国发明专利公开CN101639481A公开了一种了游离甲状腺素的磁微粒纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括游离甲状腺素系列校准品，抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液，异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液，辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素，化学发光底物液，浓缩洗涤液。该试剂盒中抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液、异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液以及辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素构成免疫反应步骤用的免疫反应试剂。该试剂盒虽然能够实现快速、准确地检测，但是其中，辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素的制备过程非常繁琐，工艺稳定性不好，且标记率低，限制其检测效果特别是分析间精密度和导致成本增加。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现游离甲状腺素准确和高精确地定量测定。 

本发明同时还提供一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度特别是分析间精密度高。 

为解决以上技术问题，本发明采取的一种技术方案是： 

一种游离甲状腺素（FT4）的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其包括用于免疫反应步骤的免疫反应试剂，该免疫反应试剂包括含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液和包被有抗荧光素（FITC）抗体的磁微粒的悬浮液，其特征在于：所述的免疫反应试剂还包括含有碱性磷酸酶（ALP）标记的游离甲状腺素抗原的溶液，该碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与游离甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。 

进一步地，所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的pH为7~9，其中的荧光素标记的游离甲状腺抗体的浓度为0.5~1μg/mL。所述的含有碱性 磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的pH为7~9，其中碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL。 

根据本发明，所述的含有荧光素标记的抗游离甲状腺素抗体能够通过成熟和稳定的工艺容易地制备。