[发明专利]大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建和表达

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一种大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建和表达，具体涉及一种根据梭菌密码子偏爱化学合成的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建，以及将此表达载体在转化入梭菌中能够成功地看到大肠杆菌lacZ基因在梭菌中表达的应用。

背景技术

虽然近年来在梭菌的代谢工程已取得相当大的成绩，但是几个必须的遗传工具的研究不佳限制了丙酮丁醇发酵的进一步发展，其中一个最重要的遗传工具就是控制外源基因表达的报告基因。一个很好的报告基因可以帮助研究者详细的研究溶剂梭菌中的不同的同源或者异源启动子，从而可以进一步理解这些启动子在梭菌中的调控功能。只有更好地理解启动子的强度和调控功能才可以产生更加有效的梭菌表达载体，这样的表达载体最终能够被用作提高丙酮丁醇发酵的溶剂产量。在理解不同启动子的强度和调控的前提下，结合反义RNA技术和基因敲除技术可以发展更加复杂的工程菌株来提高溶剂的产量。

由于目前并没有有效的梭菌外源基因表达报告系统，所以目前就没有详细的梭菌启动子的研究。而大肠杆菌基因在梭菌中表达的非常不理想，因而传统的大肠杆菌野生型报告基因在梭菌中就不能很好的使用。对于另一个在其它许多菌株中使用非常良好的报告基因--绿色荧光蛋白，由于其需要足够的氧来产生荧光的发色团，所以绿色荧光蛋白作为报告基因也不适合于梭菌。而非常适合作为梭菌报告基因的产气荚膜梭菌氯霉素乙酰转移酶则由于梭菌含有许多可能会干扰氯霉素乙酰转移酶表达的高水平非特异性的乙酰辅酶A，因而应用前景也不是很理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种大肠杆菌lacZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将其命名为EclacZS基因，它是通过梭菌偏爱密码子生物法改造人工合成的。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种梭菌OABC基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该启动子是以R27320（5’-TCT,AGA,AAA,GGA,AAA,TAT,GAT,AAA,AAA,TTT,CA-3’)和R27321（5’-GGA,TCC,CAT,TAA,TAT,CGA,AAA,TAG,CTT,AAA,CCC,AAC-3’)为引物，以梭菌的基因组DNA（GenBank:AE001437.1）为模板，用日本TAKARA公司的高保真耐高温DNA聚合酶Pyrobest经PCR扩增而得的。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种包含上述梭菌OABC基因的启动子的pYN7443质粒，它是在现有载体pSOS94的制备方法的基础上通过把原有的ptb基因启动子替换为上述梭菌OABC基因启动子构建而成的，其中pSOS94制备方法参看U-B.Tummal et al.,1999,Applied Ana Environmental Microbiology,9,3793–3799）。

本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体（pYN7443-EclacZS），它是在上述pYN7443质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入如上所述的EclacZS基因编码的序列构建而成的。

本发明所要解决的技术问题之五在于提供一种所述大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体（pYN7443-EclacZS）的构建方法，具体包括以下步骤：

1）按照梭菌偏爱密码合成生物法【Ai-Sheng Xiong，Quan-hong Yao，Ri-He Peng，Xian Li，Huiqin Fan，Zong-ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，e98:1～10】设计引物，引物均为5’端至3’端，进而合成大肠杆菌lacZ基因；

2）构建包含梭菌OABC基因的启动子的pYN7443质粒；

3）利用BamHI和SacI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将大肠杆菌lacZ基因即EclacZS序列与pYN7443质粒连接，进而得到大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pYN7443-EclacZS。

将该大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pYN7443-EclacZS转化到梭菌中并测定大肠杆菌lacZ基因的活性，具体步骤如下：

1）参照Tardif等的电击方法（C Tardif et al.,2001,Journal ofIndustrial Microbiology &Biotechnology,27,271-274）转化梭菌。