[发明专利]一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条，其特征在于，该试纸条包括：PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫，所述PVC衬板设置在最底部，同时PVC衬板上部中段设置有所述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上部左端设置有所述吸收垫，所述硝酸纤维素膜上部右端设置有所述金标垫，所述金标垫上部右端设置有所述样品垫。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜左端喷有抗副猪嗜血杆菌IgG作为质控线，所述硝酸纤维素膜右端喷有纯化复性的His-OppA融合蛋白作为检测线，所述金标垫上喷有胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白。

3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，该试纸条可以检测所有血清型的副猪嗜血杆菌感染产生的抗体。

4.一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

制备胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白；

制备胶体金垫及含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，组装构成试纸条。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，制备胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白的实现方法为：

将制备的胶体金用0.1mol/L KCO3调整pH值为7.0～7.8；

用目测法确定胶体金与待标记蛋白应标记的最佳量，得到最佳标记量为2.4mg/100ml，在胶体金溶液中按2.4mg/100ml加入纯化复性的His-OppA融合蛋白，静置30min；

将胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；

将上清液经10000r/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4℃保存。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述金胶缓冲液为含5‰蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，0.02mol/L、pH7.4。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的实现方法为：

构建重组原核表达载体Pet-30a-OppA，在大肠杆菌中诱导表达OPPA重组蛋白，用Ni-柱纯化出His-OppA蛋白，用pH为7.2、0.15M的磷酸盐缓冲液分别将纯化复性的His-OppA融合蛋白和抗副猪嗜血杆菌IgG浓度调至2.0g/l和1.4g/l工作浓度，分别按0.90l/cm设置喷膜，将蛋白和抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线与质控线，37℃烘干或室温自然干燥后，置于封闭液中浸泡10min，取出后室温自然干燥，保存备用。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述封闭液为含2.5％犊牛血清，1‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，0.02mol/L、pH7.4。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，制备胶体金垫的实现方法为：取玻璃纤维纸，按30l/cm将纯化复性的His-OppA融合蛋白喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。

10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，组装构成试纸条的实现方法为：

在PVC背衬板上由上至下分别将样品垫、胶体金垫、包括检测线及质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序装配，切割成4mm宽的条状，即制成山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条；

其中，硝酸纤维素膜黏附于PVC衬板的底板上，长30mm；硝酸纤维素膜上部左端黏附吸收垫，长25mm，并与硝酸纤维素膜重叠2mm；金标垫长5mm，并且与硝酸纤维素膜重叠2mm；样品垫长20mm，并且与金标垫重叠2mm；用切条机切割成4mm宽的条形带，密封干燥保存。