[发明专利]一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％。近年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一。

副猪嗜血杆菌病是世界性分布的条件性疾病，许多猪场有该病的存在。近年来我国养猪业发展很快，而饲养管理技术水平却相对滞后，饲养环境条件恶劣，疫病日益复杂，猪群健康水平下降，大多处于亚健康状态，这就为本病的发生与流行创造了条件。及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施，是成功防制副猪嗜血杆菌病的关键。副猪嗜血杆菌的血清型众多，有15个血清型，还有20％分离株无法分型，所以给副猪嗜血杆菌病的诊断带了很大的困难，尤其是血清学诊断。

随着分子生物学技术的发展，分子技术在细菌诊断领域广泛的应用，分子诊断在副猪嗜血杆菌的诊断中得到了广泛的应用，如基因限制性片段长度多态性分型(RFLP)技术(de la 2003；del Rio 2006等)、限制性内切酶技术(ERP)(Smart 1988)、肠杆菌基因间保守重复序列(ERIC)(Rafiee 2000)、单基因座序列分型技术和多为点序列分型(MLST)(Olvera 2006)，由于这些诊断方法需要专业的设备和技术，所以在临床上很难推广应用。

Miniats(1991)等用副猪嗜血杆菌的煮沸物或超声波破碎物致敏新鲜绵羊红细胞建立了IHA和用副猪嗜血杆菌的煮沸物或热酚水透析物建立了ELISA诊断方法；石碧(2007)等用副猪嗜血杆菌血清5型荚膜多糖建立了IHA和ELISA诊断方法，检测效果明显优于前者。IHA和ELISA是目前国内外学者探索的主要副猪嗜血杆菌病抗体检测方法，所不同的是抗原的制备方法不同。但是这些诊断方法均具有一定的局限性，全菌超破抗原成分复杂，缺乏特异性，荚膜多糖抗原抗原虽有很好的特异性，但只能检测相应的血清型的单一抗体。

发明内容

本发明提供了一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条及其制备方法，旨在解决现有技术提供的诊断副猪嗜血杆菌的方法，需专业设备和技术，并且这些诊断方法应用的局限性较大，无法满足副猪嗜血杆菌诊断的最大化需求的问题。

本发明的目的在于提供一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条，该试纸条包括：PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫，所述PVC衬板设置在最底部，同时PVC衬板上部中段设置有所述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上部左端设置有所述吸收垫，所述硝酸纤维素膜上部右端设置有所述金标垫，所述金标垫上部右端设置有所述样品垫。

进一步，所述硝酸纤维素膜左端喷有抗副猪嗜血杆菌IgG作为质控线，所述硝酸纤维素膜右端喷有纯化复性的His-OppA融合蛋白作为检测线，所述金标垫上喷有胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白。

进一步，该试纸条可以检测所有血清型的副猪嗜血杆菌感染产生的抗体。

本发明的另一目的在于提供一种检测副猪嗜血杆菌病抗体的试纸条的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

制备胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白；

制备胶体金垫及含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，组装构成试纸条。

进一步，制备胶体金标记的纯化复性的His-OppA融合蛋白的实现方法为：

将制备的胶体金用0.1mol/L KCO3调整pH值为7.0～7.8；

用目测法确定胶体金与待标记蛋白应标记的最佳量，得到最佳标记量为2.4mg/100ml，在胶体金溶液中按2.4mg/100ml加入纯化复性的His-OppA融合蛋白，静置30min；

将胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；

将上清液经10000r/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4℃保存。

进一步，所述金胶缓冲液为含5‰蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，0.02mol/L、pH7.4。

进一步，制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的实现方法为：