[发明专利]光声-荧光流式细胞仪

说明书

技术领域

本发明属于流式检测技术领域，特别涉及一种光声-荧光流式细胞仪及其检测方法与应用。

背景技术

流式细胞术是七十年代发展起来的技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞的功能，该技术是一种在功能水平上对单细胞或颗粒进行定量分析和分选的检测手段。

目前，流式细胞检测方法最常用的是荧光流式细胞术，其以连续激光照射高速流动状态下被荧光染料染色的细胞或颗粒，测量其发射荧光的强度，从而达到对细胞或颗粒进行定性或定量的检测和分析的一种细胞分析技术。荧光流式细胞仪目前已在生物医学、分子生物学等领域里被广泛应用。然而，由于依赖外源性荧光染料的荧光检测，其方法存在一定的局限性：（1）无法对暗物质(非荧光物质)进行检测；（2）荧光染料在细胞内可能会随细胞的生理状态变化而发生降解、分解或者淬灭等现象，从而无法检测到荧光而漏检。

光声效应是指短脉冲光照射某种吸收体时，吸收体吸收光能量而产生瞬间温升，温升引起吸收体的体积胀缩，从而辐射出超声波。光声效应产生依赖于激发光参数和照射对象的光吸收系数，只要有光吸收的物质都能够有效转化为超声信号而被检测，不需依赖于荧光物质。例如红细胞等带内源色素分子的非荧光物质，通过光声激发，检测辐射出来的超声就可实现光声流式检测，而无需再标记外源的荧光色素。因此，将光声流式检测与荧光流式检测的方法结合，利用同一光源同时激发光声和荧光，并同时检测两种能量模式的信号，就可实现光声-荧光双模态的流式检测术，能够有效的弥补荧光流式检测方法的不足，实现双模态，多参数，互补的流式检测新技术。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种光声-荧光流式细胞仪。该流式细胞仪的优点是使用脉冲激光作为单一激发光源，同时激发检测物质的光声和荧光信号，然后通过上下两个通路，分别同时采集被检测物质的光声和荧光信号，实现两种模态多功能的流式检测。

本发明的另一目的在于提供运用上述光声-荧光流式细胞仪的检测方法。

本发明的再一目的在于提供所述的光声-荧光流式细胞仪的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种光声-荧光流式细胞仪，包括光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统、样品台和计算机（PC机）显示控制系统；光学激发系统分别与荧光信号接收系统、样品台、计算机显示控制系统连接，光声信号接收系统分别与样品台、计算机显示控制系统连接，荧光信号接收系统与计算机显示控制系统连接；计算机显示控制系统分别与光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统电气连接；

所述的光学激发系统包括激发光源、光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A和显微物镜；激发光源与计算机显示控制系统电气连接；光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A与显微物镜依次机械连接；显微物镜与所述的样品台机械连接；光学激发系统器件全部固定在暗箱中，光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A均可在暗箱轨道中移动，对输出光进行光学整形；

所述的暗箱为覆盖整个光路的暗箱；

所述的荧光信号接收系统包括依次机械连接的二色分光镜B、滤光片、消色差透镜B、狭缝B和光电倍增管；二色分光镜B设置于反射镜和二色分光镜A之间，光电倍增管与计算机显示控制系统电气连接；

所述的荧光信号接收系统与光学激发系统成共焦结构，即荧光信号接收系统中的狭缝B与样品台分别位于前方对应的消色差透镜B和显微物镜的焦点上；

所述的光声信号接收系统包括依次连接的聚焦超声探测器和放大器；聚焦超声探测器和样品台连接，放大器和计算机显示控制系统电气连接；

所述的聚焦超声探测器的声学焦点与光学激发系统中的显微物镜的光学焦点共焦；

所述的激发光源优选为短脉冲激发光源，激发光源的作用在于激发光声信号和荧光信号；所述的激发光源的激发波长优选为400～2500nm，脉宽范围优选为1～50ns，重复频率优选为1Hz～15KHz；

更优选的，所述的激发光源的激发波长为532nm，脉宽范围为10ns，重复频率为15Hz；

所述的聚焦超声探测器的作用在于接收光声信号；所述的光电倍增管的作用在于接收荧光信号；

所述的计算机显示控制系统配置有双通道并行采集卡和采集控制软件，荧光信号和光声信号被双通道并行采集卡采集并存储到带有采集控制软件的计算机；

运用上述光声-荧光流式细胞仪检测细胞或颗粒个数的检测方法，包括以下步骤：