[发明专利]引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法。

背景技术

（1）、单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。

（2）、PIK3CA基因

PIK3CA是PI3K家族的关键成员-IA类磷脂酰肌醇-3激酶的p110α催化亚基。PIK3CA是一个34kb的基因，定位于染色体3q26.32，含20个外显子，编码1068个氨基酸，生成124kDa蛋白质，它是逆转录病毒v-p3k癌基因在细胞内的同系物。PIK3CA的功能是催化4,5-PIP2成为3,4,5-PIP3。研究已经发现在多种人类癌症（结肠癌，乳癌，脑癌，肝癌，胃癌和肺癌等）中存在PIK3CA的扩增、缺失、及体细胞突变。体细胞突变的PIK3CA其激酶活性增加并导致细胞转化。PIK3CA基因在癌症中呈现高频突变：人们对PIK3CA在多种癌症中的突变进行了检测，大量的数据表明PIK3CA有3个热点突变区，即第9外显子的E542K和E545K，以及第20号外显子的H1047R。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患者对EGFR-TKI等药物的耐药性。

（3）、目前的PIK3CA突变的检测方法

目前PIK3CA突变的检测方法有直接测序法，实时定量PCR法，液态芯片法等。其中，直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20%，且检测成本也较高；实时定量PCR法的灵敏度较直接测序法高，可达5%左右，但其通量低，且需面对其假阳性高的问题。液态芯片法的特异性和准确率高，但是需要针对突变位点设计探针和相应的微球，成本较高。

因此，我们需要找到一种灵敏度高，操作简便，成本低的方法，以求可以实现对PIK3CA热点突变快速简便准确的检测。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种引物及该引物质谱检测PIK3CA热点突变的方法；旨在解决现有技术灵敏度低，通量低，准确度不高，成本高的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：引物，包括扩增引物和测序引物，

所述的扩增引物序列如下：

SEQ ID NO:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’

SEQ ID NO:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’

SEQ ID NO:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’

SEQ ID NO:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’

SEQ ID NO:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’

SEQ ID NO:65’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’

SEQ ID NO:75’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’

SEQ ID NO:85’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’；

所述的延伸引物序列如下：