[发明专利]一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵工程领域，具体涉及高密度发酵生产谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽（glutathione, GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。谷胱甘肽作为一种活性三肤，广泛存在于大多数动物、植物和微生物中，是生物体内最重要的一种非蛋白琉基化合物。谷胱甘肽分为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种，在生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，它在细胞内主要作为抗氧化剂、免疫增加剂和解毒剂参与了许多生理活动，对生物机体的生化防御体系起着重要作用。

生物体内谷胱甘肽的生成主要通过合成和还原两条途径：谷胱甘肽生物合成由两步依靠三磷酸腺苷的酶促反应构成，首先谷氨酸和半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase)催化下合成γ-谷氨酰半胱氨酸，合成的原料由细胞外转运或通过谷氨酰转肽酶反应而来，然后在谷胱甘肽合成酶 (glutathionesynthetase)作用下，γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。而谷胱甘肽还原途径可由谷胱甘肽还原酶作用于氧化性谷胱甘肽（GSSG）而获得，参与还原作用的NADPH由磷酸戊糖途径而来。在正常生理情况下，反应主要向GSH方向进行，但GSH和GSSG这两种形态可以相互转化。

自从谷胱甘肽被发现以来，它不仅作为试剂广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定中，并且已成为一种极其重要的生物化学药物。根据国外情报机构预测，谷胱甘肽作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，它的需求量正日益增大。随着谷胱甘肽的生理生化功能和性质被不断研究发现，人们对其在医药工业、食品工业、体育运动领域及有关生物研究领域上的兴趣将日益增长，对其需求量也将不断增加。所以，谷胱甘肽具有一个极其广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于运用高密度发酵生产谷胱甘肽，可以大幅度提高谷胱甘肽产量，并有效地降低发酵成本。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种高密度发酵生产谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris SL1220）为发酵菌株，通过一级培养和二级培养后的二级种子接种于酵母培养基进行发酵培养，当发酵液OD达到100～200后，补加谷胱甘肽的前体氨基酸，控制发酵液中的碳源浓度在0.01～0.02mol/L，培养至48～64h为止。本发明选用巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris SL1220）进行优化培养。巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。所选用的巴斯德毕赤酵母其特征在于所要求的菌株为高产生物工程改造菌。

进一步：在上述高密度发酵生产谷胱甘肽的方法中，所述的一级培养和二级培养是指从新鲜斜面上挑取巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris SL1220）发酵菌株的菌体，接入装有50±5ml培养液的250ml摇瓶中，100±5rpm，32±2℃振荡培养10～12h；再以10%的接种量将一级种子接入二级种子培养液，控制pH值6.5±0.5，溶氧大于等于50%，32±2℃培养12～14h后得二级种子，所述的一、二级培养液均是本领域技术人员常用的菌种培养液。二级种子接入到酵母培养基的接种量为0.5～5%。优选的接种量为1.5%。接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例，接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。酵母培养基的碳源为葡萄糖、甲醇、糖蜜、麦芽汁、蔗糖中的至少一种，酵母培养基的氮源为酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆粕粉、氨水中的至少一种酵母培养基的碳源优选的是糖蜜，酵母培养基的氮源优选的是蛋白胨。在酵母培养基中的发酵培养pH为5.0～8.0，发酵培养温度为25～32℃。在酵母培养基中最优的发酵培养pH为6.5，最优的发酵培养温度为30℃。谷胱甘肽的前体氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一种，优选的是L-半胱氨酸。