[发明专利]DNA-壳聚糖复合纳米颗粒、其制备及应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及新型免疫佐剂，具体涉及一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒、其制备方法，及作为免疫佐剂应用。

【背景技术】

目前不断开发出的新型疫苗具有良好的抗原特异性和低毒性，但疫苗免疫原性较差。尽管已成功制备得到很有希望的抗原，却并不能诱导出足够强的预防作用。例如，可溶性纯化蛋白质疫苗或蛋白质亚单位疫苗的免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够抗体；单独应用时所需抗原量较多，机体产生的抗体量较少；且还易引起免疫耐受。但这些疫苗在与较匹配佐剂连用时，以上缺点就会有所改善。因此开发安全有效的免疫佐剂来辅助增强疫苗效力，对于更多新型疫苗在临床上的成功应用具有重要意义。

佐剂的作用方式多种多样，人们对其与免疫系统间相互作用的知识也正在逐渐丰富，并已经成为现代免疫学的重要组成部分。分别从事佐剂研究，对于深入理解佐剂作用机理和机体免疫调节方式很有意义。

免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答。理想的免疫佐剂应该能满足以下条件：（1）在有效剂量内无毒或毒性极小；（2）能刺激机体产生强大的体液免疫和/或细胞免疫应答；（3）具有持久的免疫力；（4）不诱导自身免疫；（5）无致突变、致癌、致畸形作用等。虽然现在已有许多佐剂应用于动物，但还没有哪一种佐剂能完全满足以上要求。

近年来，随着第2、3代疫苗的迅速发展，特别是多肽疫苗呈现出的极大发展空间，促使免疫佐剂也有了长足的进步。

目前通过FDA批准的能用于人的佐剂铝胶佐剂存在两方面主要缺点：其一，只能激发机体产生体液免疫，不能诱导细胞免疫。而细胞免疫对机体细胞内寄生病原体(病毒、原虫等)及肿瘤免疫力的产生尤为必要。其二，铝胶佐剂对人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、单纯疱疹病毒（HSV）、流感病毒，以及血吸虫病、百日咳和伤寒等抗原没有免疫佐剂性效果。因此已远远不能满足新型疫苗发展的要求。

纳米技术是一门具有广阔前景的新兴技术，纳米技术与免疫技术相结合的产物-纳米佐剂已成为了当前疫苗研究的热点。从免疫学观点来看，纳米佐剂均匀性好，包裹或吸附的抗原颗粒正是巨噬细胞（M5）和树突状细胞（DC）的首选吞噬目标，这为实现机体有效的免疫反应完成了重要的一步。而且纳米佐剂与多肽抗原或DNA疫苗连接后，可以避免常规佐剂载体效应的发生，起到保护抗原的作用。

【发明内容】

本发明旨在克服现有技术的以上缺陷，提供新型DNA-壳聚糖复合纳米颗粒的免疫佐剂。

具体地，本发明一方面提供一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒，为壳聚糖增溶衍生物包裹的含有AS4短发夹序列的重组质粒，所述AS4短发夹序列为通过环状序列连接的SEQ NO.1所示序列与其互补序列。

所述壳聚糖增溶衍生物可以为壳聚糖-聚乙烯亚胺-聚乙二醇聚合物。

所述环状序列可以为TCAAGAG序列。

所述重组质粒的大小可以为4610bp。

所述纳米颗粒的粒径可以为35-50nm。

所述壳聚糖增溶衍生物与所述重组质粒的的包被比例为摩尔比20:1。

本发明另一方面提供用于制备该纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

S1合成AS短发夹序列，并退火；

S2将经退火的AS短发夹序列与双酶切线性质粒、DNA连接酶在连接缓冲液中混合，转化感受态大肠杆菌，接种于含氨苄抗性的LB培养基，做抗性筛查，选取抗性菌落，得到重组质粒溶液；以及

S3将壳聚糖增溶衍生物溶液与重组质粒溶液混合，得到DNA-壳聚糖复合纳米颗粒溶液。

步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液的pH可以为5.5。

步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液与重组质粒溶液在混合前，可以分别于65℃恒温5分钟。

本发明再一方面提供该纳米颗粒作为免疫佐剂的应用。

本发明的纳米颗粒免疫佐剂均匀性好；可诱导细胞免疫；细胞毒性小；可快速有效地降低抑炎因子IL-10的表达；通过纳米颗粒包括技术，在细胞中具有缓释效应，且能保护DNA免于被细胞内核酸内切酶降解。

【附图说明】

图1示出根据本发明实施例的重组质粒的凝胶电泳检测结果。

图2为根据本发明实施例的纳米颗粒的扫描电镜图像。

图3示出根据本发明实施例的纳米颗粒的凝胶阻滞电泳检测结果。

图4示出本发明的纳米颗粒在降低抑炎因子IL-10表达上的作用。

【具体实施方式】