[发明专利]表达昆虫前胸腺激素基因的重组杆状病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达昆虫前胸腺激素基因的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。

背景技术

昆虫的生长发育、蜕皮、变态、滞育、生殖、多型现象等生理过程以及行为反应等都离不开激素的参与。蜕皮激素(ecdysone)是由前胸腺分泌的能调节动物（主要是节肢动物门昆虫纲、甲壳纲的动物）蜕皮的激素。虾、蟹的幼体和成体都有蜕皮现象，无翅亚纲动物的幼虫和成虫具有蜕皮现象，有翅亚纲动物只有幼虫有蜕皮现象。大多数昆虫幼虫有周期性蜕皮现象。

蜕皮激素是以胆固醇作为骨架合成的，但昆虫本身并不能合成胆固醇，而是直接或间接地从植物中得到。蜕皮激素由促前胸激素刺激在前胸腺合成，除前胸腺外，鳞翅目、直翅目一些昆虫的正成熟的卵巢以及鳞翅目、直翅目发育的胚胎中，也可以合成蜕皮激素类物质或中间体。通常在昆虫的前胸腺中先合成α-蜕皮激素(α-蜕皮酮)，再合成β-蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮)。β-蜕皮激素的活性比α-蜕皮激素高得多，是调节昆虫蜕皮的主要激素。

昆虫激素已成为杀虫剂研究与开发的一个重点领域，其作用机理不同于以往作用于神经系统的传统杀虫剂，毒性低、污染少、对天敌和有益生物影响小，有助于可持续农业的发展、有利于无公害绿色食品生产、有益于人类健康。

杆状病毒(baculovirus)是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，基因组大小为80-180kb。杆状病毒的结构特征为病毒粒子呈杆状，外面包被着一层蛋白质膜，外观有一定规则，称为多角体病毒（NPV）。杆状病毒专一感染节肢动物，其自然宿主主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫，还感染一些甲壳类和螨类。在自然界中，杆状病毒存在出芽病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV；又称多角体包涵体，简称PIB或OBs)两种病毒形式。BV是在昆虫细胞之间传播的一种病毒粒子，带有病毒编码的囊膜蛋白，可以与细胞表面的特定受体相结合，在昆虫体内或者细胞系的细胞之间传播。ODV是杆状病毒在环境中的传播形态，包埋于包涵体中。包涵体由多角体蛋白质组成，其外侧为多角体囊膜，在环境中非常稳定，对病毒粒子起到保护作用。未经感染的幼虫吞下含多角体包涵体的食物后，多角体蛋白在昆虫中肠中的酸性pH环境下降解，释放病毒粒子核衣壳，病毒接触并感染昆虫幼虫中肠的表皮细胞组织，制造出芽病毒粒子，芽病毒粒子通过出芽经细胞质膜进入宿主昆虫的血腔中，导致系统感染，在杆状病毒感染后期，病毒粒子被大量多角体蛋白包被，形成多角体包涵体。杆状病毒对宿主昆虫有较高的致病性，对天敌安全，不污染环境，尤其是它能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口并且不产生抗药性，明显优于其它杀虫剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达昆虫前胸腺激素基因的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。

本发明提供了表达昆虫促前胸腺激素基因的重组杆状病毒。

所述昆虫促前胸腺激素为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有昆虫促前胸腺激素功能的蛋白质。

所述昆虫促前胸腺激素基因为如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：1）序列表的序列6所示的DNA分子；2）编码区为序列表的序列2自5’末端第30至710位核苷酸所示的DNA分子；3）序列表的序列2所示的DNA分子；4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述重组杆状病毒的制备方法如下：将重组杆状病毒质粒导入昆虫细胞并培养细胞，得到重组杆状病毒；所述重组杆状病毒质粒为具有所述昆虫促前胸腺激素基因的杆状病毒质粒。

所述重组杆状病毒质粒中，可由op166启动子（杆状病毒早期启动子）和/或P10启动子（杆状病毒晚期启动子）启动所述昆虫促前胸腺激素基因的表达。所述op166启动子具体如序列表的序列5所示。所述P10启动子具体如序列表的序列8所示。

所述重组杆状病毒质粒可具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于表达所述昆虫促前胸腺激素基因的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白（Hapolh蛋白）的编码基因的表达盒。