[发明专利]引物及该引物检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体来说是引物及该引物检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法。 

背景技术

慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)细胞有t(9；22)(q34；q11)易位形成的费城染色体(Ph chromosome)和BCR/ABL融合基因，它们在血液病研究中占有重要地位。在发现Ph染色体后的30多年里，临床广泛用细胞遗传学方法检测Ph染色体做CML的诊断和疗效监测。尤其近十余年，分子生物学方法检测BCR/ABL融合基因的应用逐渐普及。甲磺酸伊马替尼(别名：格列卫，imatinib)是针对BCR/ABL融合蛋白设计的十分有效的药物，近几年在CML和Ph^＋急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)治疗中应用越来越多，但是部分患者最终出现耐药，耐药相关的BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变检测备受重视。 

BCR/ABL融合基因见于95%以上CML患者，也见于20%～25%成人ALL和2%～4%儿童ALL患者，约6%成人急性髓细胞性白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)、1%儿童AML和10%急性混合细胞型白血病(acute mixed lineage leukemia，AMLL)患者中也可检测到Ph染色体和BCR/ABL融合基因。 

不同的BCR/ABL融合基因类型与疾病表型相关。BCR/ABL融合基因中，主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。ABL基因断裂位点通常位于内含子1，包括了全部外显子2及以后的ABL基因序列。BCR基因常见的断裂点有三个：(1)M-BCR区，位于外显子b1～b5之间5.8kb的区域，转录成b2a2或b3a2型mRNA，编码210kD的BCR/ABL融合蛋白(p210)，见于90%以上的CML和33%的Ph^＋成人BALL患者。(2)m-BCR区，位于外显子e2′和e2之间的54.4kb的区域，转录成e1a2型mRNA，编码190kD的融合蛋白(p190)，见于2/3的Ph^＋成人BALL、3%的非典型CML和慢性粒细胞单核细胞白血病 (chronic myelo-monocytic leukemia，CMML)患者。(3)μ-BCR区，位于外显子19下游，转录成e19a2型mRNA，编码p230kD的融合蛋白，主要见于Ph^＋的慢性中性粒细胞白血病(chromic neutrophilic leukemia，CNL)。 

格列卫的使用使有些造血干细胞移植适应证的CML患者放弃了移植，但格列卫并不能根治CML。因为它通过抑制BCR/ABL融合蛋白的激酶活性发挥作用，本身并不能抑制融合蛋白的形成，因此停药后易复发。格列卫临床应用不久就发现耐药现象，可分为原发性耐药和继发性耐药。耐药的发生机制包括：(1)BCR/ABL融合蛋白的ABL激酶区发生突变，使格列卫结合位点酪氨酸激酶结构域的空间构象发生改变，导致格列卫不能竞争性结合融合蛋白；(2)BCR/ABL融合蛋白过度表达，超过了格列卫的竞争结合能力；(3)BCR/ABL融合基因基因组拷贝数的扩增，往往也会导致BCR/ABL融合蛋白的过度表达；(4)CML克隆的增生不完全依赖BCR/ABL，还存在其他基因异常，如多药耐药基因的异常等。可能上述一种或多种机制一起导致耐药，但约80%的耐药是由于BCR/ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的，已报道的突变超过50种。约10%的耐药是由于BCR/ABL融合基因的过量表达导致的，可能是由于基因组中BCR/ABL融合基因的扩增或其他非典型Ph染色体的出现，这种情况下增加药物剂量通常能达到一定的效果。部分患者在使用格列卫治疗前就携带有突变的克隆，是原发性耐药的主要原因。