[发明专利]基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法

权利要求书

1.一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上、下游引物,通过RT-PCR,从人肝癌细胞株BEL7402中扩增人NSE分子的cDNA全长，经TA克隆后进行DNA序列分析，确定正确的NSE基因序列SEQ ID NO.3，所述NSE为人神经元特异性烯醇化酶的简称；

（2）将SEQ ID NO.3所示基因序列定向连接入真核分泌型载体pGEM-T的NcoI和XhoI位点之间，形成质粒pGEM-T-NSE；

（3）将质粒pGEM-T-NSE转染入BEL7402细胞中，通过细胞培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；

（4）用所述质粒pGEM-T-NSE多点注射于Balb/c小鼠的股四头肌；

（5）取经步骤（4）免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；

（6）将所述杂交瘤细胞用参有荧光标记的步骤（3）获得的NSE重组蛋白的甲基纤维素制备的半固体培养基培养；

（7）将步骤（6）培养获得的杂交瘤细胞利用步骤（3）获得的NSE重组蛋白通过ELISA方法筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞株；

（8）将步骤（7）获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水；用蛋白G柱亲和纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。