[发明专利]基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法无效
申请号: | 201210576048.8 | 申请日: | 2012-12-26 |
公开(公告)号: | CN103087193A | 公开(公告)日: | 2013-05-08 |
发明(设计)人: | 魏丙卓 | 申请(专利权)人: | 天健生物制药(天津)有限公司 |
主分类号: | C07K16/40 | 分类号: | C07K16/40;C12N15/60;C12N15/85;C12N9/88 |
代理公司: | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人: | 陆艺 |
地址: | 300301 天津市*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基因 免疫 制备 神经元 特异性 醇化 单克隆抗体 方法 | ||
技术领域
本发明属于基因工程和分子免疫学领域,特别是涉及一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法。
技术背景
人神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种,存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高,外周神经和神经分泌组织的活性水平居中,最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中,特别是SCLC(小细胞肺癌)中有过量的NSE表达,导致小细胞肺癌患者的血清中NSE明显升高。
神经元特异性烯醇化酶临床意义:
神经元特异性烯醇化酶(NSE)是一种在临床上很有应用价值的分子学标记物。这是从2个方面的应用来评述的,一是NSE可以作为肺癌和儿童神经母细胞瘤的肿瘤标记物,用于小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的鉴别诊断;监测小细胞肺癌和神经母细胞瘤的病情、治疗反应和预报复发。二是NSE的活性改变同神经损伤所致的许多神经性疾病关系密切。
NSE在SCLC和神经母细胞瘤等内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性,并可在血清中直接检出。虽然NSE并不构成是SCLC的早期诊断指标,但特别是用于临床相关疾病的诊断和治疗,以及生物制品的生产和纯化等。最重要和最有意义的是,NSE活性水平变化,可以用来监测SCLC和神经母细胞瘤患者的病情发展,评价治疗效果,预报复发,其方法要比X线胸透检查来得早和方便,因此,NSE在临床中已被做为一个十分有用的血清学的肿瘤标记物予以应用。
为了进一步研究及临床诊断和治疗的需要,有学者设法从相关癌组织或癌细胞对NSE进行提取分离制备。但采用生物化学的方式进行提取制备不仅十分繁琐且得不偿失。为此国内外学者采用基因工程的方法制备NSE和NSE单克隆抗体。
目前制备NSE单克隆抗体方法的技术背景:用杂交瘤成功制备单克隆抗体技术发明至今已有30多年的历史,到目前为止单克隆抗体的种类非常繁多,已广泛地用于生命科学等领域,以往常规制备单克隆抗体的方法主要是从相关的细胞或组织中提取抗原或购买商品抗原用于免疫实验动物。抗原的来源不同其生物学性质有很多差别,特别是一些真核细胞表达的蛋白质在制备和纯化过程中使用的试剂影响蛋白质的空间结构,由此导致蛋白质的免疫原性的改变。用于制备抗体的抗原来源影响抗体生产的关键问题,有些抗原来源非常困难,甚至没有商品试剂,也没有标准品,在这种情况下制备单克隆抗体比较复杂,首先需要鉴定提取的抗原是否正确,否则免疫原错误必导致抗体的错误;因此,抗原是制备抗体的关键问题。随着分子生物学技术的发展,得到任何一个已知蛋白质的基因序列,且克隆基因和进行基因工程表达已是一个十分成熟的技术,所以大量的基因工程制备的蛋白质非常多,用于免疫动物也非常方便,许多生物公司均可以提供一定数量的纯化蛋白质,只是价格较高,另外不同公司的产品和实验人员制备的蛋白质在某些性质上还有差别,有时同一种蛋白质在免疫原性上差别很大,甚至与生理条件下天然蛋白的免疫原性相差甚远;由于蛋白质的空间结构(一级结构以上)在抗原制备过程中发生改变导致有些抗原性丢失,或暴露出非生理条件下的抗原决定簇。因为抗体用于诊断和治疗等过程时,抗体识别的抗原是天然结构,是具有一定空间结构的单体或多聚体,所以制备抗体的理想蛋白质抗原应该是具有天然结构的蛋白质,另外对于真核细胞产生的蛋白质在某些情况下还要考虑糖基化对蛋白质的影响。有些蛋白质是否糖基化将影响蛋白质的免疫原性;由于原核细胞没有糖基化系统。因此通过大肠杆菌基因工程制备的抗原没有糖基化,所以有些必须糖基化的蛋白质抗原不能用大肠杆菌制备,糖基化对有些蛋白是必须的,其影响抗原的决定簇,因此有些免疫原必须来源真核细胞(从细胞中提取或真核细胞表达)。
目前,制备NSE单抗多数以原核表达制备抗体,抗体针对天然蛋白的亲和力一直不好,以至于此抗体实用价值很低,同时人神经元特异性烯醇化酶(NSE)在体液中及细胞体外分泌的量极低,也增加了天然NSE蛋白纯化的难度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足,提供一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法。
本发明的技术方案概述如下:
一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法,其特征是包括如下步骤:
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