[发明专利]一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法

权利要求书

1.一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵（1）、第二蠕动泵（2），第一硅胶管（3）、第二硅胶管（4）、激流罐（5）、灌注袋（6）、有孔硅胶管（7）和聚酯纤维纸片载体（8）；所述灌注袋（6）为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐（5）连接，通过外源泵实现物质交换；

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，接种密度为：每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将鸭出血性卵巢炎病毒种毒接种制苗用细胞，设定设备参数：温度T1：36.5～37.5℃、T2：39～41℃、T3：34～35℃，pH：7.2～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50 r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养鸭出血性卵巢炎病毒；

c.病毒液收获

病毒培养42～46h后，收获激流罐（5）与灌注袋（6）内的病毒液，将灌注袋（6）反复冻融2～3次后收获上清液，混合后-20℃保存备用；检测病毒液效价；

d.病毒液灭活

收获的病毒液中加入甲醛灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤a中，种子细胞为幼仓鼠肾传代细胞BHK21，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞；应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。

3.根据权利要求2所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液残糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液。

4.根据权利要求3所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

5.根据权利要求4所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V 0.5%～2%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。

6.根据权利要求5所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤b中，病毒培养12h时开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培养液残糖量不低于1g/L为准；所述n等于2～5。

7.根据权利要求6所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

8.根据权利要求7所述的方法，步骤d中，收获病毒液中按V/V 1%~10%加入质量浓度为37%的甲醛溶液，70～140r/min，2-8℃灭活12～24h。

9.根据权利要求8所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤e中，在灭活的病毒液中按水相与油相佐剂V/V 3:1缓慢加入ISA 28 VG或MF59佐剂，乳化制备成水包油型鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。