[发明专利]一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，属于生物技术领域 

背景技术

鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DHO)是一种急性、高度接触性鸭传染病，是因感染鸭出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus，DHOV)所致，DHOV属于黄病毒科成员，可引起不同日龄鸭采食量、产蛋率急剧下降，甚至瘫痪。剖解主要可见卵巢出血、萎缩，卵泡变形、变性，卵黄、睾丸、输卵管和输精管萎缩。 

2010年，鸭出血性卵巢炎疾病首次发现于中国浙江，随后在江苏、山东、河北和北京等地区发生。主要见于开产蛋鸭，感染鸭群发病率几乎100%，死亡率为5%～30%，产蛋率可下降至10~30%甚至10%以下，给养鸭业带来巨大的经济损失，由于该病是病毒性疾病，目前无特效治疗方法，及时注射疫苗及预防性接种是防治该病唯一有效手段。 

目前，国内已有利用分离的流行毒株制备鸭出血性卵巢炎疫苗的研究报道，其生产工艺均为传统的转瓶生产方式，利用生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法未见报道。生物反应器作为一种新型工具，能够有效提高细胞及病毒产量，稳定疫苗批间差异，因此研究利用生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗符合行业发展趋势。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法。 

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。 

一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵，第一硅胶管、第二硅胶管、激流罐、灌注袋、有孔硅胶管和聚酯纤维纸片载体；所述灌注袋为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐连接，通过外源泵实现物质交换； 

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，接种密度为：每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将鸭出血性卵巢炎病毒种毒接种制苗用细胞，设定设备参数：温度T1：36.5～37.5℃、T2：39～41℃、T3：34～35℃，pH：7.2～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50 r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养鸭出血性卵巢炎病毒；

c.病毒液收获

病毒培养42～46h后，收获激流罐（5）与灌注袋（6）内的病毒液，将灌注袋（6）反复冻融2～3次后收获上清液，混合后-20℃保存备用；检测病毒液效价；

d.病毒液灭活

收获的病毒液中加入甲醛灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，种子细胞为幼仓鼠肾传代细胞BHK21，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞；应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。 

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液残糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液。 

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。 

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V 0.5%～2%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。