[发明专利]一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法有效
| 申请号： | 201210578347.5 | 申请日： | 2012-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN103013948A | 公开（公告）日： | 2013-04-03 |
| 发明（设计）人： | 陈坚;堵国成;方芳;李京京 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N9/18 | 分类号： | C12N9/18;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 | 代理人： | 何自刚;王玉松 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 纯化 赖氨酸 芽孢 杆菌 氨基 甲酸 乙酯酶 方法 | ||
1.一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02（Lysinibacillus fusiformis），于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2012414。
2.权利要求2所述的方法，其特征在于所述离子柱为Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：20%B、100%B液线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述疏水柱采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；B液为含有1M(NH4)2SO4的起始缓冲液，调节pH为7.0；
洗脱条件为：100%B、80%B和0%B液梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80%B液洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述离子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；
洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0%-100%B分别收集各峰并测定酶活。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述凝胶柱采用Superdex-200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS-PAGE分离。
6.权利要求1-5任一所述的梭形赖氨酸芽孢杆菌应用于氨基甲酸乙酯的降解。
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