[发明专利]一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株赖氨酸芽孢杆菌所产氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质研究。 

背景技术

氨基甲酸乙酯（英文名：urethane或ethyl carbamate，简称EC）又名乌拉坦、尿烷，是一种医药、农药、香料的中间体，或用于生产安眠药、镇静剂、注射剂的助溶剂和印染工业着色剂，也可用于生物化学研究。此外，尿烷本身可作成药使用，具有抗癌性能，用于治疗多发性骨髓瘤和慢性白血病等。 

20世纪40年代，Nettleship实验证明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用。主要可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。氨基甲酸乙酯作为副产物广泛存在于发酵食品（如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等）和酒精饮料（如葡萄酒、黄酒、苹果酒和日本清酒等）中。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。 

目前各国政府对发酵食品中EC的含量已出台相应的限量标准。 

我国生产的白酒、葡萄酒、酱油等中也广泛存在着氨基甲酸乙酯，这不仅制约我国相关产品的出口，更影响普通消费者的健康。因此采取有效的方法控制或消除发酵食品或饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02（Lysinibacillus fusiformis），于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414。 

所述离子柱为Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：20%B、100%B液线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化。 

所述疏水柱采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；B液为含有1M(NH₄)₂SO₄的起始缓冲液，调节pH为7.0；洗脱条件为：100%B、80%B和0%B液梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80%B液洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化。 

所述离子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0%-100%B分别收集各峰并测定酶活。 

所述凝胶柱采用Superdex-200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS-PAGE分离。 

所述梭形赖氨酸芽孢杆菌应用于氨基甲酸乙酯水解酶的生产或氨基甲酸乙酯的降解也属于本发明要保护的范围。 

氨基甲酸乙酯水解酶活力测定方法 

1.原理 

在一定条件下，氨基甲酸乙酯水解酶将氨基甲酸乙酯分解生成乙醇、氨气和二氧化碳。氨与苯酚－次氯酸钠反应形成靛酚蓝，用分光光度计在625nm处测其OD值，分析氨的生成量。从而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。 

2、试剂 

底物：称取3g氨基甲酸乙酯溶于100mL超纯水中，得到含量为3%EC的底物。 

显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL。 

显色剂II：称取13.125g氢氧化钠和7.5mL次氯酸钠用超纯水定容至250mL。 

终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL。 

3、酶活测定 

取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和超纯水。然后在两管中分别加入1mL底物溶液，在37℃恒温水浴箱中反应15min后，在两管各加入1mL终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂Ⅱ，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，并记录OD值。 

4、酶活计算 

酶活计算公式：酶活力＝ΔOD₆₂₅×n×k×10/15