[发明专利]一种同时检测肿瘤相关成纤维细胞和其表达蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于组织免疫荧光技术领域，具体涉及同时检测肿瘤相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblasts, CAFs）和其表达蛋白的标记方法。 

背景技术

在肿瘤发生、发展过程中，微环境充当着“土壤”的作用，是促进肿瘤进展的重要条件。肿瘤微环境由多种成分组成，除肿瘤细胞本身以外，还包括成纤维细胞、免疫或炎性细胞、脂肪细胞以及血管内皮细胞等。其中成纤维细胞数目较多。在肿瘤细胞的影响下，微环境发生了一系列变化从而更加适合肿瘤细胞的生存。CAFs是被肿瘤细胞激活的成纤维细胞，高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）是其重要标志之一。CAFs作用广泛，对肿瘤的浸润和转移起着重要的作用。它参与细胞外基质的沉积和降解，并且分泌大量的细胞因子，调节自身及周围肿瘤细胞的增殖、血管的新生和肿瘤免疫，促进肿瘤细胞的迁移。目前已有研究表明，表达在CAFs上的蛋白不仅可成为判断肿瘤预后的标志物，而且可能成为肿瘤治疗的新靶点。 

目前，肿瘤微环境已成为肿瘤相关研究的热点。CAFs所发挥的重要作用也越来越受到研究者的关注，尤其是对表达在CAFs上的肿瘤标记物的研究。要研究表达在CAFs上的肿瘤标记物，常常需要同时精确观察CAFs的标记物α-SMA及其相关功能蛋白的定位和表达情况。以往的研究中，多采用传统的免疫组织化学法进行定位观察。然而无论是免疫酶法，还是传统免疫荧光法，都有其固有的缺点，有待改进。 

免疫组织化学法：基于抗原抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、金属离子、酶等）显色来确定组织细胞的抗原，并进行定位、定性及定量的研究。由于具有特异性强、灵敏度高、技术简单等优点，免疫组织化学法常常被用于医学研究和临床病理诊断中。然而，传统免疫荧光法所发荧光易与组织高自发荧光混淆、易淬灭、结果不易长期保存、且对研究条件要求较高等缺点，限制了它的广泛应用。此外，传统荧光染料所需激发光谱较窄，使其只能用不同的激发光激发不同的荧光染料标记的抗原显色，然后通过图像合成的方法观察两种或两种以上的抗原共表达情况，过程复杂且容易产生偏倚，使结果的准确性降低。而免疫酶法的显色基于色原的沉着，不利于在同一张切片上观察两种或两种以上抗原。 

量子点（quantum dots,QDs）是一种半导体纳米晶体，直径约1-10nm，由Ⅱ-Ⅷ或Ⅲ-Ⅴ族元素组成。在激发光的诱导下，可发出荧光。到目前为止，还没有将量子点用于CAFs和其表达的肿瘤标记物的标记。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测肿瘤相关成纤维细胞和其表达蛋白的方法。 

本发明的另一个目的在于提供用于同时检测肿瘤相关成纤维细胞和其表达蛋白的试剂盒。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种同时检测肿瘤相关成纤维细胞和其表达蛋白的方法，该方法采用第一种量子点标记所述肿瘤相关成纤维细胞标记物的抗体，或者标记能与所述成纤维细胞标记物的抗体特异结合的二抗，或者标记链霉亲和素，以及至少第二种量子点标记其表达蛋白的抗体，或者标记能与所述其表达蛋白的抗体特异结合的二抗，或者标记链霉亲和素，其中第一种量子点和第二种量子点的发射波长不同，第一种量子点和第二种量子点不同时标记链霉亲和素。

所述肿瘤相关成纤维细胞标记物可以是α-SAM，所述表达蛋白可以是肿瘤标记物，或其他待检蛋白或多肽。 

具体地，本发明方法包括如下步骤： 

(1).将石蜡包埋的组织4μm厚切片固定于经多聚赖氨酸处理的防脱玻片上，然后脱蜡，水化，用TBS缓冲液冲洗3次，每次3-4min；TBS缓冲液配制方法是：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水调至1000mL，浓盐酸调pH到7.4。

(2). 配制0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液，其中A液：0.1M/L柠檬酸：柠檬酸21.0g，加蒸馏水调至1000mL，浓盐酸调pH值为6.0；B液：0.1M/L 柠檬酸钠溶液：柠檬酸钠29.41g，加蒸馏水调至1000mL，取A液1.9mL，B液8.1mL，加蒸馏水90mL，95 C微波抗原修复10min，冷却30min，TBS冲洗3次，每次3-4min； 

(3). 滴加2%胎牛血清白蛋白封闭缓冲液，37C 孵育20-30min；

(4). 滴加兔抗人待检测表达蛋白抗体和鼠抗人成纤维细胞标记物α-SAM抗体的混合物，37C 湿盒中孵育1-2h或4C过夜；