[发明专利]一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法

权利要求书

1.一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）、在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；

（2）、将离心管用PCR仪在95℃下加热3-5min，然后迅速冰浴10-20min；

（3）、在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；

（4）、将离心管置于PCR仪中，在30℃的条件下反应10-15h，反应结束后，将离心管在65℃条件下热浴10min，使phi29 DNA 聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或-20℃下低温保存；

（5）、另取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、RCA反应产物以及TaqDNA聚合酶，然后将反应液离心至管底；

（6）、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；

（7）、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。

2.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的phi29 DNA 聚合酶缓冲液为10×phi29 DNA 聚合酶缓冲液，所加入的去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA之间的体积比为5.9：1：0.5：.05：1，其中正义引物PHIB1和反义引物PHIB2的浓度均为10μM，目标物DNA的浓度为100-200 ng/μl；步骤（3）中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA 聚合酶与目标物DNA的体积比为0.5：0.1：0.5：1，其中dNTPs混合物的浓度为2.5mM each，BSA的浓度为1%，phi 29 DNA 聚合酶的浓度为10U/μl。

3.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于：步骤（2）中将离心管用PCR仪在95℃下加热3min，然后迅速冰浴15min。

4.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于：步骤（5）中加入的组分为灭菌去离子水、PCR缓冲液、浓度为2.5mM each的dNTPs混合物、浓度为10μM的正义引物PHIB1、浓度为10μM的反义引物PHIB2、RCA反应产物以及浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶，各物质之间的体积比为：18：2.5：1：1：1：1 ：0.5。

5.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于：步骤（6）中扩增的程序为：94℃ 3min，94℃ 30S，62℃ 30S，72℃ 30S，循环32-36次，最后72℃补时5min。