[发明专利]一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，尤其涉及一种高灵敏性的应用RCA-PCR技术检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法。

背景技术

柑橘冬生疫霉褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主范围广，为害柑橘生产严重，分布地域广的特点，且都可以带病果实、组织或无性繁殖材料进行远距离传播。我国柑橘种植区域分布广泛，近年来这些病原菌随着引进优质的种子苗木传人我国的几率越来越大。一旦该病传入，将对我国柑橘产业造成极大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在其他国家和地区也陆续发现。该疫病是侵染柑橘引起的是一种毁灭性病害，侵染初期，果实表皮出现浅褐色变色，感染部位皮质坚硬，湿度适合时长出白色菌丝体。受害果实味苦、具腐臭味。中国的柑橘种植区域广泛，地理气候多样，有适合病害发生的地区，故定殖可能性大。近距离传播方式有风雨、工具等传播途径，远距离传播主要以土壤、果实、繁殖材料进行传播。该病害一直持续困扰着意大利、葡萄牙等地的柑橘生产。

目前针对疫霉属真菌的系统发育已有部分研究，针对柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的分子检测技术也有PCR 检测的报道。2008年，张海峰等比较分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS 序列，在此基础上设计了1 对检测冬生疫霉的特异引物751F/752R，该对引物可从冬生疫霉菌中扩增到一条长616 bp 的DNA条带，而其它19 种疫霉和其它真菌均无扩增条带。其检测限度可达到每25 μL 反应体系只需10 fg 基因组DNA 的水平，但带菌柑橘样品的扩增条带不特别明显。因此提供一种更高灵敏性的检测方法，成了本领域内的研究热点。

发明内容

本发明提供了一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，该方法能够快速、灵敏的检测出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌，本发明提供的检测方法相比于传统的利用PCR扩增的检测方法，其灵敏性至少要高出10×4⁹倍。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，包括以下步骤：

（1）、在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；

（2）、将离心管用PCR仪在95℃下加热3-5min，然后迅速冰浴10-20min；

（3）、在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；

（4）、将离心管置于PCR仪中，在30℃的条件下反应10-15h，反应结束后，将离心管在65℃条件下热浴10min，使phi29 DNA 聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或-20℃下低温保存；

（5）、另取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、RCA反应产物以及TaqDNA聚合酶，然后将反应液离心至管底；

（6）、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；

（7）、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。

步骤（1）中所述的phi29 DNA 聚合酶缓冲液为10×phi29 DNA 聚合酶缓冲液，所加入的去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA之间的体积比为5.9：1：0.5：.05：1，其中正义引物PHIB1和反义引物PHIB2的浓度均为10μM，目标物DNA的浓度为100-200 ng/μl；步骤（3）中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA 聚合酶与目标物DNA的体积比为0.5：0.1：0.5：1，其中dNTPs混合物的浓度为2.5mM each，BSA的浓度为1%，phi 29 DNA 聚合酶的浓度为10U/μl。

步骤（2）中将离心管用PCR仪在95℃下加热3min，然后迅速冰浴15min。