[发明专利]一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法。

背景技术

人星状病毒（Human astrovirus,HAstV）是无包膜的单股正链RNA病毒，属于星状病毒科哺乳动物属。HAstV是导致幼小动物产生腹泻的一种重要病原，世界各地均已有星状病毒感染的报道，既可散发也可以引起暴发流行，亦可引起医源性感染。与轮状病毒相似，星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿。目前认为人星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因，仅次于轮状病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群，人类免疫缺陷患者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道。人星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便，可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。

1975年Madeley首次在电镜下观察到星状病毒，由于病毒颗粒表面有5～6个星状突起，故而得名。人星状病毒颗粒直径为28～41nm，当病毒存在于高pH值环境下，其表现为典型的星状形态。它的基因组从5’端到3’端包括一个约85个核苷酸的5’非编码区、3个开放读码框架（ORF1a、ORF1b、ORF2）、1个约80个核苷酸的3’非编码区和1个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，ORF1a编码丝氨酸蛋白酶，且其下游存在1个核定位信号；ORF1b编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RDRP），RDRP是通过核糖体读框移位机制合成的1个融合蛋白。HAstV衣壳蛋白由ORF2编码合成。在病毒复制的过程中，所感染的细胞内可检测出2种病毒特异性的RNA，1个是6.8KB的全长基因组RNA，另一个是2.8Kb的亚基因组RNA，2种RNA的3’端均具有多聚腺苷酸尾。亚基因组RNA包含了全部的ORF2序列，可作为mRNA表达衣壳蛋白。ORF2编码产物至少包括2个区域：第1个区域（1～415个氨基酸）在各血清型之间是高度保守的；第2个区域（416个氨基酸～结束）是高度变异的，病毒的中和抗原决定簇即在此区域内。

人星状病毒在细胞培养中增殖困难，且多数星状病毒在细胞培养物中不产生细胞病变，这为病毒分离带来了难度。目前人星状病毒的常规检测方法主要是应用电镜直接检测粪中的病毒颗粒，或用免疫诊断方法检测粪中的病毒抗原和血清中的特异性抗体。电镜检查病毒灵敏度较低，容易出现漏检；免疫学方法特异性有待提高，而且都费时费力。传统的RT-PCR也被用于人星状病毒，但检测时间需要6小时。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人星状病毒核苷酸的检测引物。

本发明的另一目的在于提供与上述检测引物配合使用的探针。

本发明的另一目的在于提供一种检测人星状病毒核苷酸的方法，该方法通过使用上述检测引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒，为人腹泻和胃肠炎的病原学诊断提供科学依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人星状病毒核苷酸的检测引物，所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’；

反向引物：5’-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。

与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如下：

探针：5’-CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料；优选的，该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。

所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2。