[发明专利]来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于极端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因、包含该基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建方法，以及它们在提高梭菌丁醇耐受性，促使梭菌提高产高含量丁醇中的应用。

背景技术

生物丁醇是是一种极具潜力的第二代新型生物燃料，与乙醇相比，丁醇作为生物燃料具有以下众多优势：1）能量含量高，与乙醇相比可多走30%的路程；2）丁醇的挥发性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，与汽油混合对水的宽容度大，对潮湿和低水蒸气压力有更好的适应能力；3）丁醇可在现有燃料供应和分销系统中使用，而乙醇则需要通过铁路、船舶或货车运输；4）与其他生物燃料相比，腐蚀性较小，比乙醇、汽油安全；5）与现有的生物燃料相比，生物丁醇与汽油的混合比更高，无需对车辆进行改造，就可以使用几乎100%浓度的丁醇，而且混合燃料的经济性更高；6）丁醇可以通过不消耗粮食、不占用耕地、不增加环境压力为前提进行发酵生产。如果丁醇占生物燃料市场的20%，全球市场将超过200亿美元。

由于丁醇具有毒性，影响细菌的生长和原料转化。目前生产中，丁醇的终浓度维持在13-14g/L，当超过这个浓度时，由于丁醇的毒性，细胞代谢就终止了（Zheng2009J Ind Microbiol Biotechnol）。经研究发现丁醇的毒性主要是破坏细胞膜的磷脂成分，从而进一步影响糖和氨基酸的吸收。目前普遍认为若细胞对丁醇的抗性得以提高，丁醇的产量也将相应提高。

泛应激蛋白（Universal stress protein，Usp）是一类在细胞质中普遍存在的小分子蛋白，通常由111-167个氨基酸残基组成。Usp最早在大肠杆菌中发现，其表达受多种胁迫影响（Nystrom1993，J Bacterio）。此后，USP蛋白在多种古生菌、细菌、植物中均被发现。USPA蛋白在埃希氏菌属大肠杆菌细胞生长受到限制，DNA被损坏时诱导表达；该蛋白在化学毒素，渗透胁迫，UV照射条件下调节细胞中的营养物质；被认为外界压力的生物传感器。研究表明该类蛋白在碳、氮、磷、硫酸盐、氨基酸等缺乏时，以及在高温、氧化、紫外线、环丝氨酸、抗生素等刺激下能积累表达（Liu2007，Micro Pathog）。Freestone等（1997，J Mol Biol）的研究结果显示，UspA作用于丝氨酸、苏氨酸的蛋白磷酸化，对细胞稳定期的生长有重要作用。在埃希氏菌属大肠杆菌细胞中发现，USPA与细胞分裂蛋白有协同作用，同时可激活RecA的表达，RecA蛋白是细菌中参与DNA同源重组修复的重要蛋白，增强细胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物参与DNA同源重组修复的重要蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用，以弥补现有技术存在的缺陷。

本发明按照梭菌的偏爱密码合成源于端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因（Genbank ZP_05570298.1），设计引物，采用PTDS方法（Xiong2004，Nucleic Acids Res）人工合成并克隆该基因，对获得的阳性克隆进行序列测定，其碱基序列如SEQ IDNO1所示，即为本发明的泛应急蛋白FaUSPA基因，命名为FaUSPAI。

进一步，本发明通过构建包含上述合成的泛应急蛋白FaUSPAI基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，使其能够在梭菌中高效表达。

所述的表达载体是以pSOS94载体为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因启动子、上述合成的FaUSPAI基因的阅读框单元和枯草杆菌pyruvate kinase基因终止子定向连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元构建而成的。

其中，从pXYP251载体中扩增氯霉素表达单元。引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’；扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。