[发明专利]一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用

权利要求书

1.氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：应用的方法步骤如下：

将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide-I-E-G-R，枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polypeptide-I-E-G-R的下游，形成polypeptide-I-E-G-R-BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。

3.抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，其特征在于：所述多肽为将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。

4.一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列；

⑵通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接； 

⑶将全部编码序列克隆入pET-28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间；

⑷在E.Coli BL21（DE3）菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白；

⑸通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。 

5.根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤⑴中来源不同的链霉菌为S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。

6.根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤⑸中荧光法检测的具体步骤如下： 

将纯化浓缩后的蛋白液各取500μL，平分成两份，其中的一份用凝血因子 Xa酶切6h，获得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光强度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子 Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。

7.根据权利要求6所述筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述荧光强度的检测步骤为：

反应体系的总体积1mL：N,N-二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris·HCl pH7.5 50 mmol/L，DTT 3mmol/L，酶液200μL；反应体系于37℃反应30min，加入10mmol/L(NH₄)₂SO₄终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。