[发明专利]一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶(枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶简称BTG)活性的多肽及其筛选方法和应用。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TG)，是一种催化酰基转移反应的酶，能催化蛋白质分子内、分子间以及蛋白质与氨基酸之间形成ε-(γ-Glu)-Lys异肽键使其共价交联聚合，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能，因而该酶在食品工业和医药工业中具有广泛的应用。TG的生产方法有动植物组织提取法和微生物发酵法两种。TG的早期生产采用动物组织提取法，但由于动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故，酶的生产应用一直受到很大限制。微生物来源的TG因其酶活性不依赖Ca²⁺，且最有希望实现工业生产，引起了广泛关注，目前仅茂源链霉菌来源的TG实现了商业化生产应用在食品加工中。链霉菌属来源的TG具有信号肽和前肽，由于前肽的作用，使得链霉菌来源的TG在细胞内没有活性，而不损害细胞，然后通过信号肽分泌到细胞外，实现TG的生产。

和链霉菌来源的TG相比，枯草芽孢杆菌来源的TG研究要少得多，1996年才由Kobayashi等首次在枯草芽孢杆菌中发现了TG，其没有信号肽和前肽，只存在于芽孢上，交联芽孢表面蛋白，防止其被蛋白酶降解，从而起到保护芽孢的作用。由于TG具有蛋白交联的活性，对宿主细胞具有毒性作用，因此，虽然2007年葡萄牙Placido等实现BTG在大肠杆菌中表达，但是在不同的诱导和培养条件下酶得率都非常低。目前，仍难以大量制备枯草芽孢杆菌来源的BTG。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献：

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用，该多肽使BTG能够在宿主细胞低活性表达，减轻BTG对宿主细胞的毒性作用，而经过蛋白酶简单处理后其活性又能得到恢复，为BTG的高效表达奠定了基础。

本发明采取的技术方案是：

氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。

而且，应用的方法步骤如下：

将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide-I-E-G-R，枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polypeptide-I-E-G-R的下游，形成polypeptide-I-E-G-R-BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。

抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，所述多肽为将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。

一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，步骤如下：

(1)选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列；

(2)通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接；

(3)将全部编码序列克隆入pET-28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间；

(4)在E.Coli BL21(DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白；

(5)通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。

而且，所述步骤(1)中来源不同的链霉菌为S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。

而且，所述步骤(5)中荧光法检测的具体步骤如下：

将纯化浓缩后的蛋白液各取500μL，平分成两份，其中的一份用凝血因子Xa酶切6h，获得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光强度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。

而且，所述荧光强度的检测步骤为：