[发明专利]抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物及其制备方法及制剂

权利要求书

1.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌作为病原体，所述耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌、耐药停乳链球菌、耐药无乳链球菌以及耐药大肠杆菌中的一种或多种；

S2、将所述耐药致病菌粉碎处理后，加入福氏佐剂，再高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药致病菌复合抗原；

S3、采用所述耐药致病菌复合抗原对具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫，再拣取所产的免疫蛋；

S4、对所述免疫蛋进行消毒，取蛋黄，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY；

S5、制备引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌的复合噬菌体，包括耐药致病菌为耐药金黄色葡萄球菌噬菌体、耐药停乳链球菌噬菌体、耐药无乳链球菌噬菌体以及耐药大肠杆菌噬菌体；所述步骤S5包括：

1)分别取耐药金黄色葡萄球菌菌株、耐药无乳链球菌菌株、耐药停乳链球菌菌株、耐药大肠杆菌菌株各一批，加入无菌水制成四种菌悬液；

2)分别在三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的发酵罐中，加入预处理的污水溶液与耐药金黄色葡萄球菌、耐药无乳链球菌、耐药停乳链球菌、耐药大肠杆菌菌悬液中的其中一种菌悬液，37℃培养12～24小时；

3)将以上四种混合培养液高速离心，将离心所得上清液进行真空过滤除菌，并将滤液在37℃培养过夜；

4)分别在肉膏蛋白胨琼脂平板上加入四种菌悬液中一种，将菌悬液涂布成均匀的薄层，待平板上的菌悬液干后得到平板菌层，分散滴加数滴滤液于平板菌层上面，37℃培养过夜，分别得到无菌生长的耐药金黄色葡萄球菌噬菌斑、耐药无乳链球菌噬菌斑、耐药停乳链球菌噬菌斑和耐药大肠杆菌噬菌斑；

5)分别取步骤1)中四种菌悬液接种于液体培养基内，混合均匀；再取上层琼脂培养基，溶化并冷却,分别加入步骤4)中对应的噬菌斑的噬菌体混匀；再注入底层培养基上混匀，置37℃培养后过滤除菌，即得到纯化的噬菌体；

6)分别将步骤3)制得的四种耐药菌的过夜培养液按照1﹕100加入到LB液体培养基中，振荡培养至菌液对数生长前期；以感染复数0.1～1加入对应的步骤5)中制得的四种噬菌体中一种，混合均匀并静置，随后振荡培养至宿主菌完全裂解，噬菌体裂解液离心取上清过滤除菌，制得四种噬菌体中之一种的扩充滤液；

7)将步骤6)制得的四种噬菌体扩充滤液按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，得到复合噬菌体；

S6、将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体按照(1-10):(1-10)比例混合，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。

2.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中将噬菌体裂解液8000r/min离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

3.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中将所制得的抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY和复合噬菌体混合，置入搅拌机中充分混合均匀，制得抗牛乳房炎耐药菌特异性IgY与复合噬菌体组合物。

4.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，其特征在于，采用权利要求1-3中任意一项所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物的制备方法制得。

5.一种抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，其中包括根据权利要求1-3中任意一项所述方法制备的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物，还包括针剂辅料或乳膏辅料。

6.根据权利要求5所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为针剂，所述针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。

7.根据权利要求5所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为乳房灌注剂，所述针剂辅料包括油、表面活性剂、以及蒸馏水。

8.根据权利要求5所述的抗牛乳房炎耐药菌IgY与复合噬菌体组合物制剂，其特征在于，所述制剂为乳膏，所述乳膏辅料包括油、钛白粉、以及微粉硅胶。