[发明专利]热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶及其制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及诊断用酶技术领域，具体讲是一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶及其制备方法。

背景技术

糖化白蛋白（GA）是指人血清中葡萄糖与白蛋白N末端发生非酶促糖化反应而形成的产物，其中90%与白蛋白链内的赖氨酸ε-NH2残基发生反应，其反应原理为两者首先形成不稳定的葡基胺（Glycosylamine）或Schiff碱基（Schiff Base），后者再经不可逆的葡糖胺（Amadori）重排反应形成稳定的氨基酮（酮胺）。因白蛋白的半衰期大约是20天，所以糖化白蛋白检测可被用于检测过去2-3周平均血糖水平。

如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白，因为其关键步骤在于果糖赖氨酸氧化酶的催化反应，所以果糖赖氨酸的性质决定了测量方法的精密度。然而目前已有的果糖赖氨酸氧化酶热稳定性差，不能很好的满足工业化需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种能在较高温度下保持良好稳定性的果糖赖氨酸氧化酶。

本发明的技术解决方案如下：

一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶，基于果糖赖氨酸氧化酶的基因序列，通过易错PCR技术，构建果糖赖氨酸氧化酶的突变文库，将突变文库转入大肠杆菌，进行两轮筛选，得到了40℃下热处理10分钟酶活大于95%的热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。该热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID.No.2所示序列。

一种编码热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示序列。

本发明的的突变菌株筛选方法如下：

1) 以Aspergillus terreus GP1的果糖赖氨酸氧化酶基因序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖赖氨酸氧化酶的突变文库；

2) 将步骤1)所述的突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；

3) 利用醌法测定酶活性，筛选出热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。

Aspergillus terreus GP1含有果糖赖氨酸氧化酶的编码基因,本发明是以该基因序列为模板设计两条引物，上游引物序列为：     5'-CTCGGATCCATGCCAGTCACCAAG-3'，下游引物序列为：5'-CCCCTGCAGCTATAACTTCGAGATG-3'；经易错PCR扩增，所得片段经回收后，用BamHI和PstI酶切并连接于可热诱导裂解的载体pEAS-1a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞，涂布于LB平板上，并于30℃培养12-24小时后，将所获得的含有单克隆的平板用印章法复制到一块新的含有IPTG的LB复制平板上，将该复制平板于30℃培养6个小时，充分诱导果糖赖氨酸氧化酶表达，然后依次在38℃条件下放置2小时，在30℃下放置1小时，以使细胞充分裂解，在45℃下放置30分钟，最后在复制平板上均匀喷洒反应液，并转移至30℃放置30分钟，对于颜色变化明显的单克隆，从复制平板上挑选出来，作为下一步筛选的基础，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM。

将初步筛选得到的单克隆，接种于96孔板中进行定量测活。方法如下：细胞在30℃下生长6小时，然后加IPTG诱导6小时，再依次转移至38℃下2小时及30℃下1小时进行热诱导裂解，离心，取上清，将上清置于45℃条件下放置30分钟后加入反应液孵育30分钟，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM；检测555nm吸光度，得到一株热稳定性较高的菌株；通过序列分析发现与野生型相比共有五个碱基位点发生突变，分别为123T→C，174C→T，494C→G，698C→G，755A→G，相应地涉及到三个氨基酸的突变，分别为199A→G，233T→S，258N→S，将该基因命名为FAOD-MK18。

一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，它包括以下步骤：

1) 菌体的获得：培养含有重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌种，加入IPTG诱导2-8小时，离心收集菌体，收集的菌体用缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清；

2) 硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤1)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；