[发明专利]一种重组制癌肽的制备方法

权利要求书

1.一种重组制癌肽的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；

步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物F₁、F₂、R₁，以F₂为模板，R₁为引物进行延伸反应；

步骤三，以延伸反应产物为模板，F₁、R₁为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定；

步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET-SUMO-OP表达质粒进行序列分析；

步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定；

步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据所设计的序列，设计并合成的三条引物。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，以F₂为模板，R₁为引物进行延伸反应的具体过程为：

在无菌PCR管中加入以下试剂：5μL F₂(10μmol/L)、5μL R₁(10μmol/L)、16μL dNTP(10mmol/L)、10μL 10×连接缓冲液、63μL H₂O。94℃孵育30s，55℃温浴10min，离心5s，加入1μL Taq酶，72℃孵育5min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，以延伸产物为模板，F₁、R₁为引物进行PCR反应的具体过程为：

在无菌PCR管中加入以下试剂：1μL延伸反应液、2μL F₁(10μmol/L)、2μLR₁(10μmol/L)、1μL dNTP(10mmol/L)、5μL 10×PCR缓冲液、Taq酶0.2μL，最后加双蒸水补足体积至50μL。PCR循环参数如下：94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles，72℃延伸10min。

用无水乙醇沉淀DNA，12000rpm×10min离心，弃除上清液，再用70％乙醇洗涤2次，弃除残余乙醇，TE缓冲液溶解。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，产物鉴定的实现方法为：

称取0.75g琼脂糖，加入50mL 1×TAE缓冲液；

微波炉加热使琼脂糖溶解，溶液冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL；

装好电泳槽模具，将胶倒入其内，迅速在模具一侧安插梳子，等凝胶冷却凝固；

小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中；

加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面离于胶面1mm；

取1μL DNA样品与适量Loading Buffer混匀后加入点样孔中，接通电泳槽和电泳仪的电源，电压调至94V；

待指示剂迁移至2/3凝胶处，中止电泳；

将胶转移至紫外线透射仪下观察有条带后，再放置在凝胶成像系统上拍照。剩下DNA样品送往上海生物工程技术有限公司测序。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，回收PCR产物的具体过程为：

灌制1％的普通琼脂糖凝胶，在加样孔下方2cm处切一个约1×0.8cm²的小孔，用相应浓度的低熔点凝胶填充，16℃凝固；

在加样孔中加入100μL PCR产物后电泳，待样品进入低熔点凝胶中，在310nm的紫外灯下切取目的条带，放入到1.5mL Ep管中称重，按试剂盒说明回收目的DNA；

加30μL Elution Buffer入回收柱中37℃静置2min，10000rpm离心1min，Ep管中液体即为回收的DNA溶液。