[发明专利]一种重组制癌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术药物领域，尤其涉及一种重组制癌肽的制备方法。

背景技术

最近有研究发现肿瘤干细胞除了高致瘤性之外，具有很强的迁移能力，并涉及肿瘤转移的形成。最初的微小转移灶发生在血管周围的微环境中，随后，其生长直至出现明显的临床症状需要多种复杂的肿瘤-间质相互作用。整合蛋白是细胞外基质蛋白的细胞表面受体，在包括信号传导、细胞粘附、细胞存活、增殖、迁移、血管形成和基因表达等很多生物行为中起重要作用。最近的研究表明，αv整合蛋白在CSCs中过表达。此外，与定型的起始前列腺癌祖细胞亚型相比，av整合蛋白在前列腺癌CSCs群中表达增高。给予人的αv-siRNA能够显著的抑制骨组织中前列腺癌移植瘤细胞生长，并诱导肿瘤细胞调亡。抗血管生成剂，如JF-10-81，一种喜树碱偶联物，可以减少αvβ3和αvβ5在前列腺癌PC3细胞系中的表达，同时可以阻碍体内肿瘤细胞在血管的粘附和血管生成。总之，抑制αv整合蛋白的功能是一种有希望的靶向CSCs治疗恶性肿瘤的策略。

发明内容

本发明提供了一种重组制癌肽的制备方法，旨在提供具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用的制癌肽。

本发明的目的在于提供一种重组制癌肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；

步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物F₁、F₂、R₁，以F₂为模板，R₁为引物进行延伸反应；

步骤三，以延伸反应产物为模板，F₁、R₁为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定；

步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET-SUMO-OP表达质粒进行序列分析；

步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定；

步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。

进一步，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列如下：aca atg cca ttc tta ttc tgc aat gtc aat gat gta tgt aat ttt gca tct cgg aatgat tat tca tac tgg ctg acc cca ctt ggt gac aca act cac aca tcc gga tgc aac tac tat tca aattcc。

进一步，在步骤二中，根据所设计的序列，设计并合成的三条引物为：

F₁：5’-ACAATGCCATTCTTATTCTGCAATGTCAATGATGTATGTAATTTTGCATCTCGAAATG-3’；

F₂：5’-TAATTTTGCATCTCGAAATGATTATTCATACTGGCTGACCCCACTTGGTGACACAACT-3’；

R₁：5’-GGAATTTGAATAGTAGTTGCATCCGGATGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGGG-3’。

进一步，在步骤二中，以F₂为模板，R₁为引物进行延伸反应的具体过程为：

在无菌PCR管中加入以下试剂：5μL F₂(10μmol/L)、5μL R₁(10μmol/L)、16μL dNTP(10mmol/L)、10μL 10×连接缓冲液、63μL H₂O。94℃孵育30s，55℃温浴10min，离心5s，加入1μL Taq酶，72℃孵育5min。