[发明专利]合成和纯化寡聚物的新方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及寡核苷酸的试剂、合成和纯化领域。

背景技术

寡核苷酸是短链核酸聚合物，典型地含有几个至几百个核苷酸。它们是基因组研究和生物技术的重要工具。虽然寡核苷酸可以通过较长前体的分裂产生，但是现在它们更通常是由单体以序列特异性的方式合成。它们典型地是在固体载体上使用亚磷酰胺化学或磷酸酯化学合成。

图1A显示了一个使用亚磷酰胺的固相寡核苷酸合成的典型合成循环。四个主要步骤包括：1)脱三苯甲基化；2)偶联；3)封端；和4)氧化。如图1中所示，第一核苷酸被化学键合到固体载体(例如，可控孔度玻璃珠(controlled pore glass bead))上。这些可以以预键合到固体载体上的第一核苷酸的形式从商业来源购买。

要启动合成，使用温和的酸(例如，惰性溶剂如二氯甲烷或甲苯中2％或3％的三氯乙酸)将第一核苷酸的5′-羟基的保护基团(常用的5′-羟基的保护基团是三苯甲基(即，-C(Ph)₃)或4，4′-二甲氧基三苯甲基，其可以缩写为DMT，DMTr)除去。然后，将具有3’-亚磷酰胺基团(例如，3′-O-(2-氰乙基-N-N-二异丙基)亚磷酰胺)的5′-DMTr保护的第二核苷酸偶联到固体载体上的第一核苷酸上游离的5′-羟基基团上。该偶联可以通过使用酸性唑催化剂(例如，1H-四唑)在乙腈中活化亚磷酰胺而实现。然后将活化的亚磷酰胺与游离的5′-羟基反应，以形成亚磷酸三酯链接(linkage)。

因为偶联反应的效率永远不会是100％，所以一些游离的5′-羟基将会保留。使用乙酸酐和酰化催化剂(例如N-甲基咪唑)将任何未反应的5′-羟基封端，以防止失败序列(failure sequence)在下一个循环中反应。封端之后，将亚磷酸三酯氧化，从而将它转化成磷酸酯链接。氧化可以用碘在弱碱(例如吡啶)的存在下完成。这些步骤完成了第一偶联循环。所述方法可以重复多个循环直到合成了期望的寡核苷酸。

类似的方法在图1B中示出，其使用了H-膦酸酯单体代替亚磷酰胺。除了仅需要一个氧化步骤并且是在合成结束时进行之外，大部分步骤是类似的。

在链延长完成时，寡核苷酸仍附着在固体载体上并且完全被保护。为了提供功能性的寡核苷酸，需要除去保护基团并且需要将寡核苷酸产物从固体载体上释放。这些可以使用碱溶液(例如氢氧化铵或甲胺水溶液)以及可能的其它预处理步骤(例如2-氰乙基保护基团的脱保护)完成。

上述合成步骤可用于DNA或RNA寡聚物的合成。然而，对于RNA的合成，2’-羟基需要用耐受反应条件的基团进行保护。典型的2’-羟基的保护基团包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)。

通常，偶和步骤不会100％完成。未完成的反应导致短链体(short-mer)的形成。如上提到的，短链体典型地使用试剂例如乙酸酐进行封端，以防止它们在反复的固相合成中生长。这通常导致产生寡聚物池，所述寡聚物池由短链体(n-1、n-2、n-3等聚体)和期望的全长产物组成。图2的(A)和(B)分别显示了HPLC色谱和PAGE分析，以证明产物是含有一些失败序列的混合物的事实。

来自寡核苷酸合成的产物总是含有失败序列(较短的寡核苷酸，大部分是n-1聚体)。传统上使用HPLC或硅胶电泳例如PAGE纯化这些粗产物。虽然这些方法对于纯化短寡核苷酸是可以接受的，但是对于纯化较长的寡核苷酸(例如50-300聚体)却是不能接受的。另外，这些方法可能是昂贵并且耗时的，可能消耗大量的溶剂并且可能仅限于熟练的的专业人员使用。