[发明专利]氧化应激指示物表达用核酸构建物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及氧化应激指示物表达用核酸构建物。具体而言，氧化应激是与Nrf2-Keap1通路有关的应激。

本发明也涉及使用上述核酸构建物来测定氧化应激的方法。

本发明还涉及使用上述核酸构建物来筛选氧化应激抑制用药剂的方法。

背景技术

氧化应激是指机体内的活性氧类的生成和清除系统的平衡紊乱、活性氧类过量的状态。如果该状态发展下去，则构成机体的核酸、蛋白质、脂类等被氧化，对机体产生损伤。细胞如果暴露于氧化应激或亲电子性物质，则会通过诱导表达谷胱甘肽合成酶、血红素加氧酶1(HO-1)等抗氧化蛋白质和II相解毒酶来参与机体防御(非专利文献1)。这种基于氧化应激的基因表达机制中，存在于基因上游的抗氧化剂应答元件ARE(Antioxidant Response Element)和与其结合的转录因子Nrf2起着重要的作用(非专利文献2和3)。

Nrf2是碱性亮氨酸拉链(bZip)型转录因子，作为针对氧化应激、亲电子性应激、毒性化合物及致癌物质等的细胞防御的重要控制因子起作用(非专利文献3、4、5和6)。在常规条件下，Nrf2通过由其与Keap1(Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH associating protein 1)；其是Cul3系泛素E3连接酶复合物的底物衔接蛋白）的结合介导的泛素-蛋白酶体通路而迅速地分解(非专利文献7～10)。如果暴露于氧化应激或亲电子性应激，则Keap1中的多个反应性半胱氨酸残基被共价键修饰，通过由Keap1介导的分解而释放出Nrf2。其结果是，发生Nrf2的稳定化和随后向核中的转移，在核中，Nrf2与小Maf家族蛋白的成员形成二聚体。该复合物由已知作为氧化/亲电体应答元件(ARE/EpRE)的顺式作用DNA元件(cis-acting DNA element)介导，激活大范围的转录(非专利文献2和3)。

重要的是，体外和体内模型显示，Keap1-Nrf2系统与阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症等神经变性疾病有关，或是减轻该疾病(非专利文献11)。此外，使用Nrf2基因敲除(Nrf2 KO)小鼠的最近的研究表明，Nrf2的机能障碍与人类疾病的病况有关，Nrf2在人类疾病中有可能起着重要的作用(非专利文献12～14)。还有，最近人们发现，Nrf2作为急性肺损伤和急性炎症的机体侧防御因子起着重要的作用(非专利文献15)。

迄今为止，氧化应激和针对氧化应激的细胞应答反应主要用培养细胞来进行研究，此外，关于监控氧化应激状态的报告物(reporter)，也只知道低灵敏度的报告物。还有，氧化应激的检测一般通过测定某种蛋白质的表达量来进行。具体而言，通过以下方法进行：通过蛋白质印迹分析来测定氧化应激诱导性的转录因子Nrf2的表达量，或者通过RNA印迹分析来测定在其下游诱导的HO-1的表达水平。但是，这些方法由于存在将细胞裂解的过程，因此难以在个体水平上确定受到氧化应激的脏器。迄今为止，制作了由氧化应激依赖性地受Nrf2诱导的启动子来使碱性磷酸酶表达的报告物，但灵敏度不足，而且报告蛋白不适于个体观察，因此不能进行动物个体的分析，而只是停留在培养细胞水平的分析(非专利文献16)。

此外，迄今为止，已知将应激诱导性启动子和蛋白质分解控制位点组合而成的报告物(非专利文献17)，包含荧光或发光蛋白、标记蛋白及调节蛋白的用于测定氧化应激的探针试剂(专利文献1)等。

综上所述，体内的氧化应激研究应该能提供在与氧化应激有关的神经变性疾病、心血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎等疾病的病理、发病和细胞生物学上有用的信息。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际申请第WO2009/1078号小册子

非专利文献

非专利文献1：Rushmore TH等, J. Biol. Chem. 1990;265(24):14648–14653

非专利文献2：Rushmore TH等, J. Biol. Chem. 1991;266(18):11632-11639

非专利文献3：Itoh K等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997;236:313-322

非专利文献4：Moi P等, Proc. Natl Acad. Sci. USA 1996;91:9926–9930

非专利文献5：Venugopal R等, Proc. Natl Acad. Sci. USA 1996;93(25):14960–14965