[发明专利]具有改善的热稳定性的逆转录酶

说明书

技术领域

本发明涉及逆转录酶，更确切来说涉及通过对组成传统逆转录酶的特定氨基酸残基进行突变而得的具有改善的热稳定性的逆转录酶。

背景技术

已经进行了很多关于RNA肿瘤病毒，尤其是莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney-Murine Leukemia Virus，M-MLV）、人HIV、或禽类成髓细胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）来源的逆转录酶的研究，并因此已经公开了它们的功能和特性。逆转录酶由于其有助于通过使用RNA作为模板合成互补DNA（cDNA）这一独特特性，已被用于许多分子生物学方法，例如，cDNA文库构建、逆转录和聚合酶链式反应（PCR）等。

主要研究了逆转录病毒的逆转录酶的三种原型（prototype）。莫洛尼鼠白血病病毒来源的逆转录病毒包含78kDa的单个亚基，该亚基具有RNA依赖性的DNA聚合酶活性和RNase H活性。将所述酶克隆并在大肠杆菌（E.coli）中以真实的（authentic）活性形式表达。HIV来源的逆转录酶为p66亚基和p51亚基的异二聚体。p51亚基由对p66亚基进行蛋白水解裂解而生成。p66亚基既包含RNA依赖性的DNA聚合酶结构域、还包含RNase H结构域；但p51亚基仅包含DNA聚合酶结构域。将活性HIV来源的p66/p51逆转录酶克隆并在很多表达宿主（包括大肠杆菌）中表达。在HIV p66/p51异二聚体中，51kDa亚基为催化惰性的；而66kDa亚基显示出DNA聚合酶活性和RNase H活性。与此同时，禽类肉瘤-白血性增生病毒（Avian Sarcoma-Leukosis Virus，ASLV）逆转录酶如Rous肉瘤病毒（RSV）逆转录酶、禽类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶、禽类成红细胞增多症病毒（Avian Erythroblastosis Virus，AEV）辅助病毒（helper virus）MCAV逆转录酶、禽类骨髓细胞瘤病毒（Avian Myelocytomatosis Virus）MC29辅助病毒MCAV逆转录酶、禽类网状内皮组织增生病病毒（Avian Reticuloendotheliosis Virus，REV-T）辅助病毒REV-A逆转录酶、禽类肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV逆转录酶、禽类肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV逆转录酶、Rous相关病毒（RAV）逆转录酶以及成髓细胞性白血病相关病毒（Myeloblastosis Associated Virus，MAV）逆转录酶均为α亚基（约62kDa）和β亚基（约94kDa）两个亚基的异二聚体。α亚基由对β亚基进行蛋白水解裂解而生成。ASLV逆转录酶可存在α/β和β/β两种催化活性结构。由沉淀分析（sediment analysis）证实，所述α/β结构和β/β结构均为二聚体，并且此处的α以介于单体和二聚体的平衡状态存在。ASLVα/β逆转录酶或β/β逆转录酶是迄今为止已知的唯一一种具有三种不同活性（如DNA聚合酶活性、RNase H活性以及DNA核酸内切酶（整合酶）活性）的逆转录病毒逆转录酶。所述α结构既不具有整合酶结构域也无整合酶活性。

将mRNA通过逆转录酶介导的逆转录转变成cDNA在基因表达的研究中非常重要。然而，在许多方面不优选使用未转化的逆转录酶作为中介体（mediator）来进行逆转录。在第一链反应开始之前或当其结束时，逆转录酶有时会通过RNase H活性来降解RNA模板。由于mRNA模板的错误引发（mis-priming），在cDNA的第一链中也存在错误的机会。事实上，在cDNA合成期间，HIV逆转录酶出错多达每3,000-6,000个核苷酸发生1个核苷酸错误；而AMV逆转录酶每10,000个核苷酸发生1个核苷酸错误。

影响逆转录酶效果的另一因素为RNA能否形成二级结构。当RNA分子具有足够的互补性以形成双链RNA时，可形成此类二级结构。一般来说，可通过提高含RNA分子的溶液的温度来减少RNA二级结构的形成。因此，优选在高于37℃下进行RNA逆转录。在远高于37℃的温度下（例如，在50℃下）进行培养时，逆转录酶活性丧失。