[发明专利]使用改进的免疫复合物(IC) ELISA来检测抗体

说明书

本发明涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本发明人教导了FcγR例如CD16、CD32或CD64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物(即由抗原和特异性抗体所形成的复合物)形式的抗体。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。

在各种出版物中，已经描述了高度灵敏的免疫复合物(IC) ELISA用于针对以下的IgG抗体的检测：巨细胞病毒(Sachers, Emmerich等人, 1985)、拉沙病毒衣壳抗原(Emmerich, Thome-Bolduan等人, 2006)以及西尼罗(West Nile, WN)病毒和蜱传脑炎(TBE)病毒表面的型特异性抗原(Ludolfs, Niedrig等人, 2007; Ludolfs, Reinholz等人, 2009)。后两种测试使用各自的黄病毒的ED3结构域，不再显示使用市售常规ELISA或间接免疫荧光(IIF)通常可见的黄病毒之间的交叉反应性。原则上，包被有来自类风湿性关节炎患者的类风湿因子(RF) IgM的板有效结合免疫复合物(IC)，其在含特异性IgG抗体的人血清样品和各自的过氧化物酶标记的抗原(酶标抗原，ELA (Sachers, Emmerich等人, 1985)混合后形成。

与使用抗原包被的板和带标记的抗人IgG样间接ELISA或IIF的抗体测定相比，IC ELISA被证明具有若干优势。

通过添加血清样品和各自的ELA，对于阳性结果需要2个免疫步骤。特异性抗体必须与抗原反应，然后聚集，即免疫复合，IgG抗体与固相上的RF IgM结合。因此，涉及到2个免疫机制。

检测IC的方法具有优势，具体地讲，使用IC ELISA时，大大过量的单体IgG (其在使用间接ELISA或IIF测试时通常引起背景反应)不再产生背景染色，并且可采用1:10的低血清稀释。因为过氧化物酶(POD)–标记，低分子量抗原将会聚集，其促进形成具有许多POD分子的大IC。因此，可以使用高稀释的ELA (对于西尼罗和TBE ELA，通常1: ≥20 000)。这也有助于低背景染色。

因为可以以高稀释度应用各种ELA，所以可以加入过量大约100倍的竞争性交叉反应的未标记抗原(Ludolfs, Reinholz等人, 2009)。因此，可以增加IC ELISA对选择性表位的特异性。最后，IC ELISA在技术上操作非常简单，因为抗原和抗体可同时应用，并且对测试进行染色前仅需一个孵育和洗涤步骤。

WN-和TBE- IC ELISA的高特异性已有文献证明，其使用接受TBE疫苗者和WN感染后的患者的大量血清样品。与IIF或间接ELISA (其中这些样品中的许多都显示出众所周知的交叉反应)相比，在WN IC ELISA中使用TBE样品，未见反应(P/N< 1)。反之亦然，在TBE IC ELISA中使用WN热恢复期患者的样品，未观察到交叉反应性。(Ludolfs, Niedrig等人, 2007; Ludolfs, Reinholz等人, 2009)。

人或动物抗体对不同黄病毒的交叉反应性是众所周知的现象。使用针对西尼罗病毒、登革热病毒或TBE病毒的包膜糖蛋白的小鼠或甚至人单克隆抗体，已经鉴定出共有的黄病毒表位。例如，针对西尼罗病毒或登革热病毒的包膜蛋白的80%小鼠单克隆抗体具有交叉反应，仅很少数单克隆抗体，大部分是针对包膜蛋白的ED3结构域(8%)，对所述的病毒具有特异性。高免疫原性ED3是推定的受体结合结构域，并且若干中和单克隆抗体与WN或登革热病毒的ED3结合。