[发明专利]使用内部对照定量人类DNA的方法

说明书

发明领域

本发明属于分子生物学、诊断学领域，更具体来说属于分析和法医学领域。本发明还属于核酸扩增和定量领域，更具体来说属于DNA定量领域。

此外，DNA污迹中不同贡献者的存在的早期评估，通常是调查期间非常重要的信息部分。在这种情况下，由于多个贡献者的干扰，STR分析将引起困难。

混合样品的具体实例是含有女性和男性DNA混合物的性侵犯污迹。男性：女性DNA比例的准确测定帮助选择最适的下游STR分析。在可获得的罪犯DNA的量非常低的情形中，可以执行针对专一存在于Y染色体上的遗传元件的特定类型的STR分析，从而排除女性贡献物的干扰。

背景技术

从法医样品以及其他样品回收的DNA的量的测定，不仅在总体DNA分型方法中，而且在各种其他科学领域中的DNA检测中，都是关键的步骤。为了使用例如多重DNA分型试剂盒产生最优结果，通常需要0.5至2ng的狭窄的输入DNA范围。因此，为了确保阳性结果确实是阳性结果，和/或阴性结果确实是由不存在DNA造成的阴性结果，DNA的定量是绝对重要的。此外，用于法医DNA测试实验室的标准品的质量，需要人类特异性DNA定量。这是由于分离技术可能回收人类DNA以及细菌和其他外源DNA。为了对人类特异性DNA进行定量，已经开发了许多程序步骤，包括起始印迹（start-blot）技术、基于液体的杂交测定法和实时PCR（聚合酶链反应）。目前，实时PCR由于其宽的动态范围并易于自动化，是主导技术。

现代STR试剂盒已变得越来越灵敏，即使在使用少量DNA时也能获得良好结果。因此，对于即使在低度浓缩的样品中也允许精确和准确定量人类DNA的方法、试剂盒和核酸区域，存在着需求。已经有一些定量和检测试剂盒可用，然而它们具有严重缺点。一种这样的试剂盒是Quantifiler Human试剂盒（Applied Biosystems），另一种试剂盒是Quantifiler Duo试剂盒（Applied Biosystems），另一种试剂盒是Plexor HY实时PCR定量试剂盒（Promega）。Quantifiler Duo试剂盒和Plexor HY试剂盒两者靶向基因组上的常染色体和性染色体（Y染色体）靶点。

试剂盒的缺点：根据LaSalle等，（Forensic Science International:Genetics,“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”（Analysis of Single and Multi-copy Methods for DNA Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction）），Quantifiler试剂盒在定量上更准确，但是与Plexor HY相比具有较低的动态范围。Plexor HY由于扩增多拷贝靶而提供更高的动态范围，但是具有较低准确性。这种较低的准确性可以归因于多拷贝靶。如果对基因组上全套少于20个拷贝进行扩增，由于例如靶拷贝数的不稳定性，则常染色体与性染色体（Y）靶的扩增之间的比率可能变化。Plexor HY试剂盒的动态范围略好于另一试剂盒（LaSalle等，Forensic Science International:Genetics,“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”（Analysis of Single and Multi-copy Methods for DNA Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction））。在统计学比较中，LaSalle等证实了这两种试剂盒之间的显著差异。

法医学中的另一个重要参数是必须进行分析的DNA的降解等级。由于Quantifiler Human和Plexor HY试剂盒的扩增子大小在62至133个碱基对（bp）之间变化，因此当将试剂盒应用于降解的DNA时，预计可能出现显著差异。此外，抑制剂必须被考虑在内。有可能反应中存在DNA，但由于抑制性物质的存在而没有获得结果。

发明概述

本发明解决了上面认识到的问题，并提供了下面概述的解决方案。