[发明专利]用于生产具有修饰的O-糖基化的蛋白的酵母菌株

权利要求书

1.在低等真核生物宿主细胞中生产具有O-Man-GlcNAc；O-Man-GlcNAc-Gal；或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia作为其主要O-聚糖的重组糖蛋白的方法，所述方法包括：

(a) 提供低等真核生物宿主细胞，其

     (i) 不表达功能性的β-甘露糖基转移酶Bmt 1、2、3和4，和磷酸-甘露糖转移酶Mnn4a、Mnn4b和Pno1；和

     (ii) 表达功能性蛋白O-连接的甘露糖β-1,2-N-连接的乙酰葡糖胺基转移酶1 (POMGnT1)、UDP-GlcNAc转运蛋白和α-1,2-甘露糖苷酶；

(b) 使用编码目标糖蛋白的核酸转染或转化所述低等真核生物宿主细胞；和

(c) 培养所述宿主细胞，从而产生所述重组糖蛋白。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述细胞进一步不表达Ktr1。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(ii)的所述酶进一步包括下列酶组合中的一种：

(a) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白和UDP-Gal差向异构酶；

(b) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,6SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST；或

(c) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,3SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(ii)的所述UDP-GlcNAc转运蛋白是乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运蛋白或鼠UDP-GlcNAc转运蛋白。

5.权利要求1所述的方法，其中所述α-1,2-甘露糖苷酶衍生自里氏木霉(Trichoderma reesei)、酵母(Saccharomyces sp.)、球孢子菌(Coccidiodes sp.)或曲霉(Aspergillus sp.)。

6.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶包含SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 118。

7.权利要求1所述的方法，其中来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶衍生自人、鼠或蛙POMGnT1序列。

8.权利要求1所述的方法，其中编码来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶的核酸经过密码子优化用于在所述低等真核生物宿主细胞中的表达。

9.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(ii)的所述POMGnT1由编码可操作地连接到ER和/或高尔基体前导序列的POMGnT1的核酸序列编码，其中，所述ER和/或高尔基体前导序列是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母的前导序列或衍生自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母的前导序列。

10.权利要求9所述的方法，其中所述ER和/或高尔基体前导序列衍生自下列蛋白之一的序列：ScMNS1-s、ScMNN9-s、PpKre-2s、KlGnt1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s。

11.权利要求9所述的方法，其中所述编码POMGnT1的核酸序列可操作地连接到选自SEQ ID NOs: 1-108的序列。