[发明专利]用于生产具有修饰的O-糖基化的蛋白的酵母菌株

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及经过遗传工程化以产生具有人源化O-糖基化的糖蛋白的低等真核生物细胞，例如酵母菌株，以及所述糖蛋白从重组表达系统的生产。

背景技术

低等真核生物(即，酵母和丝状真菌)与哺乳动物(特别是人)的O-糖基化途径和模式之间存在显著的结构差异。因为人免疫系统可将低等真核生物的可变糖基化(alternative glycosylation)识别为外来物，所以，在真菌系统中产生的任何基于蛋白的治疗性产品在注射进人体时都有可能激发致免疫反应。这种反应可能限制治疗剂在多次施用中的功效，并且，在最严重的病例中，可能导致患者的不良影响。

实际上，真菌糖基化的存在是人先天免疫系统进行清除的常见信号；参见，例如Ballou, C.E., 1990 Methods Enzymol. 185:440。这引发了对于在酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中生产，并注射到人体内的治疗性蛋白质(包括但不限于具有酵母典型的N-和O-聚糖的蛋白质)的快速清除或免疫原性的潜力的担忧。

旨在降低酵母中生产的治疗性蛋白质的免疫原性的此前尝试主要集中在降低N-聚糖的免疫原性(参见，例如Gerngross的美国专利7,029,872)。更为近期的尝试则集中在共同降低或消除真菌的O-糖基化，从而降低或消除这种反应；参见，例如Tanner，美国专利5,714,377；和Bobrowicz等，WO2007/061631。与此相反，本发明人意外地发现，生产具有类似于在天然的人糖蛋白上所见的O-糖基化，或更接近于在哺乳动物细胞中产生的重组糖蛋白上所见的O-糖基化的某些O-糖基化模式的蛋白的预料不到的优点。

发明内容

本发明提供了用于生产重组糖蛋白的方法和材料，其中所述重组糖蛋白具有可用于开发人治疗剂或兽医治疗产品的改进特征。在某些实施方案中，本发明包括低等真核生物宿主细胞(包括酵母和丝状真菌)，其经工程化以产生主要具有类似于人的(human-like) O-聚糖的糖蛋白。在优选的实施方案中，宿主细胞生产主要具有选自O-Man-GlcNAc、O-Man-GlcNAc-Gal或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia的类似于人的O-聚糖的糖蛋白。

作为第一方面，本发明提供了用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞，其通过敲除和/或失活一种或多种参与O-糖基化的基因而进行修饰，所述基因包括但不限于编码β-甘露糖基转移酶(bmts；参见，例如US 2006/0211085)、磷酸甘露糖转移酶的那些基因，或参与O-糖基化的一种或多种其他基因。

作为第二方面，本发明提供了如上文所述的那些用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞，其中，所述低等真核生物宿主细胞通过转染或转化参与O-糖基化的外源基因，且特别是编码蛋白质O-甘露糖β-1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1 (PomGnT1)或其催化结构域的基因，以及编码人或哺乳动物O-糖基化途径中的一个或多个步骤的一种或多种其他基因而进行修饰，以表达参与人或哺乳动物O-连接糖基化途径的外源(非天然)基因。在具体的实施方案中，这些一种或多种其他基因非限制性地编码以下酶或其催化结构域：UDP-GlcNAc转运蛋白；α-1,2-甘露糖苷酶；β-1,4-半乳糖转移酶(β1,4GalT)；UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)；UDP-Gal差向异构酶；α-2,6-唾液酸转移酶(α2,6SialT)；α-2,3-唾液酸转移酶(α2,3SialT)；UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)；N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶(SPS)；唾液酸化-9-P磷酸酶(SPP)；CMP-唾液酸合酶(CSS)；和CMP-唾液酸转运蛋白(CST)。

作为第三方面，本发明提供了如上文所述的那些用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞，其中，所述宿主细胞通过使用编码糖蛋白的外源基因转染或转化宿主细胞而进行修饰，以表达目标重组糖蛋白。这样，在用于表达的适当条件下培养时，如本文所述的宿主细胞将表达并分泌包含具体的类似于人的O-糖基化的改进的重组糖蛋白。