[发明专利]在糖蛋白产品中包含N-乙酰己糖胺的N-聚醣

说明书

本申请要求2011年3月12日提交的美国申请序列号61/452,092的优先权。该在先申请的披露内容被视为本申请的披露内容的部分（并且通过引用结合在此）。

发明领域

本发明涉及用于检测糖蛋白中的特定聚糖结构的方法和材料。

发明背景

抗体表示在药物市场中和在针对多种适应症的开发中日渐发展的一类生物治疗药物。与小分子不同，生物制剂实际上是亚型的混合物，所有的这些亚型包含相同的肽主链但在修饰上不同，并且它们可以具有一系列的药代动力学、药效动力学或安全性曲线。因此重要的是例行地监测产品质量。抗体是包含至少一个可变地被占的N-糖基化位点的糖蛋白。认为在抗体治疗剂中的N-糖基化影响该分子的药代动力学和结构整体性（Krapp（克拉普），Mimura（米姆拉）等人2003）。

发明概述

本发明在部分上是基于可以存在于糖蛋白（例如，糖基化抗体）上的N-乙酰己糖胺聚糖结构的发现。在一些实施例中，N-乙酰己糖胺的存在或量与一种或多种具体生产参数相关联。可以将此聚糖结构的不存在、存在和/或量用于（除其他之外）评估或加工一种糖蛋白制品，从而例如确定是否接受或拒绝一批糖蛋白（例如，糖基化抗体）、或者指导或控制用于产生糖蛋白（例如，糖基化抗体）的一种或多种生产参数。在一些实施例中，可以将在糖蛋白组合物中此结构的不存在、存在或量与例如一个参比标准进行比较，从而例如作出关于该糖蛋白制品的决定，例如分类、选择、接受或丢弃、释放或留存、加工成一种药物产品、装运、移动到一个不同的位置、配制、贴标签、包装、准予进入贸易、或销售或许诺销售该糖蛋白（例如糖基化抗体）的决定。在其他实施例中，该决定可以接受、改变或拒绝一种或多种用于制造糖蛋白（例如，糖基化抗体）的生产参数。

因此，在第一方面，本披露的特征为用于评估一种糖蛋白制品的方法。在一些实施例中，该方法包括：

提供糖蛋白的一种或多种制品，例如糖基化抗体制品；并且

例如使用分离方法，对与糖蛋白相关联的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在和/或量进行确定。

该确定步骤可以包括以下各项的一个或多个：(a)对由一种细胞产生的糖蛋白进行分离，并且确定N-乙酰己糖胺聚糖是否存在于该糖蛋白上，(b)对由一种细胞产生的糖蛋白制品进行分离，并且对在该制品的糖蛋白上N-乙酰己糖胺的存在或量进行确定，(c)将聚糖从由一种细胞产生的糖蛋白分离，并且确定该糖蛋白的聚糖是否包含N-乙酰己糖胺聚糖，并且(d)提供来自由细胞产生的糖蛋白的至少一种肽，并且对在该至少一种肽上的包含N-乙酰己糖胺的聚糖的存在进行确定。用于测量N-乙酰己糖胺的技术可以包括以下方法中的一种或多种以及任意这些方法的组合：色谱法、质谱（MS）法、电泳法（例如，毛细管电泳）、核磁共振（NMR）法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子（例如抗体或凝集素）。

聚糖的来源可以选择下组，该组由以下各项组成：细胞群，例如CHO细胞；分离的糖蛋白，例如分离的糖基化抗体；从糖蛋白（例如糖基化抗体）的切割衍生的肽；或从糖蛋白衍生的聚糖。在一些实施例中，该方法包括用一种或多种酶（例如，PNGase）处理聚糖或糖肽的来源，随后为聚糖群体的分析。在一些实施例中，此方法包括用一种化学品处理糖肽以释放聚糖（例如，酸水解）、随后为所释放的聚糖或单糖的分析和/或连接至单一氨基酸上的聚糖的分析。

在一些实施例中，所使用的方法提供了N-乙酰己糖胺聚糖的定量测量。在一些实施例中，所使用的方法提供了定性测量。

在一些实施例中，该方法还包括制备一种糖蛋白制品，将一种或多种聚糖从糖蛋白制品切割（例如，用一种或多种酶，如PNGase），并且对N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行确定。

在某些实施例中，该方法是在治疗性糖蛋白的生产运行期间通过以下方式进行：从生产线的细胞培养物获得一个样品，从而例如对在生产期间的聚糖结构进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在细胞的培养时期期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在一些实施例中，该方法是在糖蛋白的储存期间通过以下方式进行：从糖蛋白组合物获得一个样品，从而例如对在储存期间的聚糖结构稳定性进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在糖蛋白组合物的储存期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在其他实施例中，该方法是对糖蛋白组合物而进行，例如作为该糖蛋白组合物的质量测试或释放测试的部分。