[发明专利]核心蛋白聚糖组合物及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。

发明背景

携带一条或多条糖胺聚糖(GAG)链的蛋白聚糖形成一个大的基因家族，该家族根据核心蛋白的结构性质可被分成五组。其中一组是小的富亮氨酸的蛋白聚糖家族，该家族由核心蛋白聚糖(DCN)、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和光蛋白聚糖组成。它们的特征在于40kDa的核心蛋白，该核心蛋白含有约12个氨基酸的富亮氨酸重复。DCN是该组的原型，并且也称为PG-S2、PG40、硫酸蛋白皮肤素(proteodermatan sulphate)和DS-PGII。它含有一条共价连接到成熟核心蛋白的丝氨酸的皮肤素硫酸软骨素GAG链，并被视为多功能的蛋白聚糖。

所提出的DCN功能包括但不限于调控胶原原纤维形成、通过与纤连蛋白和血小板反应蛋白结合而维持组织完整性以及作为转化生长因子β(TGF-β)的贮存器(reservoir)。DCN的后一功能通过其核心蛋白将细胞外环境中的生长因子与细胞表面上表达的受体相隔离而实现。

将核心蛋白聚糖输注到实验性啮齿动物脊髓损伤处已表明可抑制疤痕形成并促进轴突生长。核心蛋白聚糖也已在实验性鼠肿瘤模型中证实了具有抗肿瘤发生的特性并且能够抑制多种肿瘤细胞系的生长。对于核心蛋白聚糖基因，存在多种已知的选择性剪切转录变体。核心蛋白聚糖基因中的突变与先天性基质层角膜营养不良相关。

本领域需要的是改进的产生核心蛋白聚糖的方法，尤其是针对治疗性用途。

发明概要

本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。

因此，在一些实施方案中，本发明提供包含可操作地连接到编码核心蛋白聚糖的序列的异源信号肽的融合蛋白。在一些实施方案中，信号序列为α-乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，α乳白蛋白序列为牛α-乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，编码核心蛋白聚糖的序列编码核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变。在一些实施方案中，突变为丝氨酸到丙氨酸突变。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的实质性修饰。

在一些实施方案中，本发明提供编码上述融合蛋白的载体。在一些实施方案中，载体包含编码α-乳白蛋白信号序列的核酸序列，所述α-乳白蛋白信号序列可操作地连接到编码核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。

在一些实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供产生非糖胺聚糖化(non-gagylated)核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括：提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培养所述宿主细胞的培养基中。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与离子交换介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与羟基磷灰石介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与至少一种离子交换介质和至少一种羟基磷灰石介质按任何顺序接触。在一些实施方案中，纯化包括：将所述培养基与阳离子交换介质接触；洗涤所述阳离子交换介质；从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；洗涤所述羟基磷灰石介质；从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，阳离子交换介质为SP-琼脂糖FF。在一些实施方案中，羟基磷灰石介质为陶瓷羟基磷灰石I型。在一些实施方案中，方法还包括用离子交换膜或柱进一步纯化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，离子交换膜为Q离子交换膜。在一些实施方案中，方法还包括病毒灭活步骤。在一些实施方案中，病毒灭活步骤包括用表面活性剂处理。在一些实施方案中，表面活性剂为Triton X-100。在一些实施方案中，方法还包括病毒过滤步骤。在一些实施方案中，方法还包括浓缩所述核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通过所述宿主细胞以约大于1、5或10pg/细胞/天的速率产生。