[发明专利]回收植物来源的蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及回收植物来源的蛋白质的方法。更具体地,本发明提供从植物和植物组织获取蛋白质(包括蛋白超结构(suprastructure))的方法。

背景技术

目前宿主细胞(例如大肠杆菌、昆虫细胞培养物和哺乳动物细胞培养物)中的重组表达策略在培养基中以非常高的水平表达和分泌蛋白质。使用这些系统获得了高水平表达、正确蛋白质折叠和蛋白质翻译后修饰。此外,由于可以容易地将细胞内蛋白质与其他组分(DNA、囊泡、膜、色素等)分离,所表达蛋白质的纯化得以简化。对于植物或酵母表达系统,细胞壁阻止表达的蛋白质分泌到培养基中。

广泛使用不同的科学方法来产生细胞提取物。对于某些类型的蛋白质或细胞组分,通常不选择机械方法来破坏细胞壁并释放其内容物。将目的蛋白质直接表达入细胞培养基,使得能够通过离心或过滤去除细胞内杂质,从而使目的蛋白质被简单快速地富集。还可期望在将目的蛋白质或蛋白超结构用于疫苗配制之前,从存在于植物或植物物质中的一些或全部蛋白质、DNA、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等中分离目的蛋白质或蛋白超结构,包括蛋白花环(protein rosette)、纳米颗粒、大蛋白复合物、抗体或病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)等等。

免疫球蛋白(IgG)是对多种性质的特定抗原性对应物有特征性亲和力的复杂异多聚体蛋白质。当今IgG产生细胞系的常规分离和IgG定向进化和分子改造技术的出现极大地影响了它们作为生物治疗剂和在一般生命科学应用中的改进。治疗性单克隆IgG(单克隆抗体,mAb)在目前的新抗炎药和抗癌药市场中占主导地位,并且目前正在对数百种新候选药物进行研究和临床开发以获得改进的或新的应用。每年mAb的市场需求从几克(诊断)、几千克(抗毒素)到一百或数百千克(生物防护、抗癌、抗感染、抗炎)。WO2008／151440(通过引用并入本文)描述了从植物生产经修饰的糖蛋白的方法。

PCT公开WO00／09725(Turpen等)描述了一种从植物细胞间间隙提取蛋白质的方法,其包括真空和离心处理以提供包含目的蛋白质的间质液(interstitial fluid)提取物。该方法适于能在真空和离心条件下通过微纤维网格的小蛋白质(50kDa或更小),但不适于较大蛋白质、超结构蛋白(superstructure protein)、蛋白花环、纳米颗粒、大蛋白复合物例如抗体或VLP。

1999年McCormick等(Proc Natl Acad Sci USA96：703-708)公开了使用与单链Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信号肽将表达的蛋白质靶向到细胞外部分(compartment),随后通过对叶和茎组织进行真空过滤来回收scFv多肽。2008年Moehnke等(Biotechnol Lett30：1259-1264)描述了使用McCormick的真空过滤法通过质外体提取从烟草中获得重组植物过敏原。PCT公开WO2003／025124(Zhang等)公开了在植物中表达scFv免疫球蛋白,其通过鼠信号序列靶向质外体空间。

病毒样颗粒(VLP)可用于制备疫苗,例如流感疫苗。超结构(例如VLP)模拟病毒衣壳结构,但缺少基因组,从而不能复制或提供再次感染。VLP刺激强免疫应答,为分离(可溶)的重组抗原提供了改进的替代方法。VLP在特定病毒蛋白表达后进行组装并具有类似于其同类病毒的外表面,但不同于真的病毒颗粒,遗传物质不会整合到其中。与天然病毒类似的颗粒状多价结构抗原的呈递引发具有均衡的体液和细胞成分的增强的免疫应答刺激。认为优于分离抗原产生之刺激的这种改进对于包膜病毒尤其适用,因为包膜VLP以其天然膜结合状态呈递表面抗原(Grgacic和Anderson,2006年,Methods40,60-65)。此外,已证明与重组血凝素HA(即单体HA,或组成花环的HA；3-8个三聚体的HA组装物)相比,拥有纳米颗粒组织结构的流感VLP是更佳的候选疫苗,并且他们能激活体液和细胞免疫应答。(Bright,R.A.,等,2007,Vaccine25,3871-3878)。

之前WO2009／009876和WO2009／076778的发明人已描述了包含脂质包膜的流感HA VLP的生产(D'Aoust等；两者均通过引用并入本文)。对于包膜病毒,病毒保留脂质层或膜可以是有利的。不同系统的脂质构成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒会在包膜中包含植物脂质或植物甾醇),这可有助于增强免疫应答。