[发明专利]体外确定个体患结直肠癌概率的方法及试剂盒

说明书

发明领域

本发明涉及检测结直肠癌，特别涉及用于确定患这种癌症的概率的方法及试剂盒。

背景

结直肠癌（CRC）也称为结肠癌或大肠癌，是美国第五最常见癌症形式，中国第四位常见癌症及欧洲癌症相关死亡的第三位因素。CRC早期检测是成功治疗及患者存活的关键，代表主要公共健康挑战。事实上，CRC经常是可治愈的，特别是当在早期诊断时。在各个国家已有一些筛查策略。传统CRC筛查测试包括大便潜血试验（FOBT）、乙状结肠镜检测结肠镜检查、双重对比钡剂灌肠、或者直肠指检。所有这些均具有优点和限制，但是依从性仍低于预期，主要由于患者的不便或者不适。

寻找目的在于CRC早期检测的外周血生物学标记物几年来成为焦点，特别是因为其方便性。同时，只有极少研究支持基于血液的测试的可行性，这些研究发现血液中的基因生物学标记物可以区分CRC患者和对照。这些研究基于流式细胞术，其是计数和检查显微颗粒如细胞的技术，所述技术通过将它们悬浮在液流中并用电子检测装置分析它们。

本发明人发现，在外周血样品中，差异表达的基因代表重要的生物学标记物。它们不使用经典流式细胞术技术，而是确定来自全血的基因的差异表达。通过分析全血中的转录物来确定基因表达水平是不寻常的，因为本领域技术人员普遍承认，当无特异性纯化步骤时，非常难以获取稀释于RNA复杂混合物（总RNA）中的特异信息。本发明方法的优势还包括避免RNA纯化步骤。

因此，本发明涉及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，所述方法包括步骤：

a)在外周血样品中确定来自至少一种核酸序列且不超过7种核酸序列的至少一种表达产物的量，所述核酸序列选自SEQ ID NO:1-11的序列，

b)将步骤a)中确定的所述表达产物的量与一组先前诊断为结直肠癌患者的个体的表达产物的参考量以及与一组先前确认为非结直肠癌个体的个体的表达产物的参考量进行比较，

c)进行步骤b）结果的分析，其中：

-如果测试个体的结果接近或等于得自先前诊断为结直肠癌患者的个体组的结果，则该测试个体被分类为结直肠癌患者，而

-如果测试个体的结果接近或等于得自先前确认为非结直肠癌个体的个体组的结果，则该测试个体被分类为非结直肠癌个体。

表达产物的量直接与由其核酸序列限定的基因的表达水平相关。

至少一种上述核酸的表达水平是确定个体是否是CRC的足够信息。但是，在本发明优选实施方案中，在步骤a）中，来自选自下组的核酸序列的表达产物的量被确定：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。

来自核酸的表达产物的量通过将所述表达产物与特异于每种表达产物的至少一种结合配偶体接触而确定。

表达产物是指RNA转录物或多肽。因此，在本发明方法中，至少一种RNA转录物或至少一种多肽的量被确定。

术语RNA转录物是指总RNA，即直接得自外周血样品或细胞裂解后间接得自血液样品的编码或非编码RNA。特别地，总RNA包含转移RNA（tRNA），信使RNA（mRNA），如从靶基因转录也从其他基因转录的mRNA，以及核糖体RNA。

具体说明，当RNA是胞内RNA时，其可以通过裂解步骤从血液样品中存在的细胞提取，以释放待测个体细胞中含有的核酸。例如，可以使用如下专利申请中描述的裂解方法：WO00/05338，涉及混合磁性及机械裂解，WO99/53304，涉及电裂解，WO99/15321，涉及机械裂解。本领域技术人员可以使用其它熟知裂解方法，例如热休克或渗透压休克，或者使用离液剂如胍盐的化学裂解（美国专利号5,234,809）。还可以提供额外步骤以从裂解步骤释放的其它细胞组分分离核酸。这通常能够浓缩核酸。