[发明专利]使用包含CMP或酪蛋白种类的给料来分离骨桥蛋白的方法有效
申请号: | 201280015495.4 | 申请日: | 2012-03-05 |
公开(公告)号: | CN103492408A | 公开(公告)日: | 2014-01-01 |
发明(设计)人: | 汉斯·贝特尔森;彼得·朗堡·魏谢;特赖因·特鲁格瓦森 | 申请(专利权)人: | 阿拉食品公司 |
主分类号: | C07K1/18 | 分类号: | C07K1/18;C07K14/47;C07K14/52 |
代理公司: | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人: | 牟静芳;杨淑媛 |
地址: | 丹麦*** | 国省代码: | 丹麦;DK |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 使用 包含 cmp 蛋白 种类 分离 方法 | ||
发明领域
本发明涉及一种用于从一种乳源给料(例如,基于乳血清(milk serum)或甜乳清的一种给料)中分离骨桥蛋白的方法。具体来说,本方法涉及使用该乳源给料的一个窄窗位的pH和比电导,这已经出乎意料地被证明实现了从化学上复杂的给料中非常有效地分离骨桥蛋白。
发明背景
骨桥蛋白是一种酸性的、高度磷酸化的、唾液酸丰富的、钙结合蛋白。骨桥蛋白含有约28摩尔结合磷酸盐/摩尔骨桥蛋白,并且结合约50摩尔钙/摩尔骨桥蛋白。
骨桥蛋白(OPN)是在许多生物过程中涉及的一种多功能生物活性蛋白,这些生物过程如骨重塑、异位钙化抑制、以及细胞粘附与迁移、还有若干免疫功能。骨桥蛋白具有细胞因子样特性并且是启动T辅助1型免疫应答的一个关键因素。骨桥蛋白存在于大多数组织和体液中,并且发现在乳中浓度最高。
为了支持在异位钙化中OPN的抑制功能,使用了OPN缺陷小鼠的体内模型在外源性添加这种蛋白质时显示出钙化减弱。此外,在泌尿道防御肾结石的形成中涉及OPN,因为OPN可以抑制一水草酸钙晶体的生长和聚集。
目前尚不清楚乳中OPN的生物学作用;然而,可以推测若干功能。已经报道在乳腺发育和分化中涉及骨桥蛋白,并且已经在泌乳早期在乳腺中观察到高水平的OPN表达。此外,该蛋白质的高阴离子性质可以使得OPN能够与钙离子形成可溶性络合物,并且从而抑制乳中无意的钙结晶和沉淀。
在科学文献中,骨桥蛋白典型地是从骨或乳中纯化出的,并且该蛋白质典型地以20mg/L的浓度存在于牛乳中。在乳中,骨桥蛋白是一种血清蛋白,但取决于Ca2+的水平还可能在一定程度上与酪蛋白胶束缔合。酸乳清是用于骨桥蛋白的工业生产的优选原材料。当酸乳清形成时,骨桥蛋白被认为在Ca2+泄漏进入血清相时离开酪蛋白胶束。此方面使酸乳清成为骨桥蛋白的一个直接来源。由于相同的原因,甜乳清具有稍低的骨桥蛋白质含量。此外,甜乳清含有来自κ-酪蛋白(kappa-casein)的酶裂解的酪蛋白巨肽(CMP)。CMP与骨桥蛋白在生化方面具有许多相似之处-都是小的、柔性的、酸性的、磷酸化的糖蛋白。由于此原因,CMP和骨桥蛋白被认为在其结合离子交换树脂方面相当类似,这将在从含CMP的原材料中纯化骨桥蛋白中造成问题。另一方面是由用于奶酪制作的蛋白水解酶所引起的骨桥蛋白的可能降解。无论是对于工业生产还是对于科学研究,这三个方面可能已导致避免使用这种原材料来纯化骨桥蛋白。
现有技术
WO02/28413A1描述了一种借助于低pH阴离子交换来从给料(如乳和酸乳清)中生产含骨桥蛋白的组合物的方法。在WO02/28413A1中,强调了无论是工艺给料还是所得的产品都不可能含有cGMP,cGMP是已知结合阴离子交换剂并且将抑制骨桥蛋白的结合的一种类型的CMP。
WO01/149741A2描述了一种方法,其中通过以下方式从一种乳材料中纯化出骨桥蛋白:将该乳材料与可溶性钙混合并调节该混合物的pH,以便选择性地沉淀乳清的其他蛋白质组分同时保留溶液中的骨桥蛋白。
发明简述
本发明人已经发现,出乎意料地并且与在现有技术中发现的偏见相反,可以通过阴离子交换从多种复杂的乳源给料中以高产量和高纯度分离出骨桥蛋白,尽管给料存在多种竞争蛋白。本发明人已经发现,给料的比电导对于骨桥蛋白的产量和纯度特别重要,并且已经确定了用于从乳源给料中分离骨桥蛋白的最佳比电导窗位。
因此,本发明的一个方面涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料,所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导,
b)使所述乳源给料经受阴离子交换色谱法,包括使该乳源给料与一种阴离子交换介质进行接触,
c)可任选地,洗涤该阴离子交换介质,并且
d)回收结合至该阴离子交换介质的蛋白质,从而获得包含分离的骨桥蛋白的一种组合物。
本发明可以例如涉及一种用于从一种乳源给料中分离骨桥蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供包含骨桥蛋白的一种乳源给料,所述乳源给料具有在25℃下pH3.6-6.5的范围内的pH以及在25℃下4-10mS/cm的范围内的比电导,并且其中所述乳源给料进一步包含
-相对于乳源给料的蛋白质的总量而言量为至少1%(w/w)的酪蛋白巨肽,或
-游离α酪蛋白和游离β-酪蛋白,
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