[发明专利]使用捕获标记物的三磷酸化寡核苷酸的纯化

说明书

描述

本发明涉及使用捕获标记物制备三磷酸修饰的寡核苷酸的方法。该方法可以以高产量和适用于药物应用的纯度合成和纯化三磷酸修饰的寡核苷酸。

发明背景

Schlee等，Immunity，2009，31，25-34描述了在一条链上携带5’-O-三磷酸酯部分的钝端双链RNA，通过结合RIG-I解螺旋酶，作为有效的免疫系统的刺激剂。因此，对提供简单且有效的用于制备适用于药物应用的高纯度三磷酸修饰的寡核苷酸的方法存在需求。

三磷酸酯基团或其类似物与核苷化合物的5’-OH基团的偶联是本领域公知的。Ludwig J.等，J.Org.Chem.1989，54，631-635公开了使用2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮作为亚磷酸化剂的用于制备核苷和类似物的5’-O-三磷酸酯的溶液三磷酸化方法。Gaur R.K.等，1992，Tetrahedron Letters，33，3301-3304描述了在固相上使用所述方法，用于合成2’-O-甲基核糖核苷5’-O-三磷酸酯及其P_α-硫代类似物。美国专利6,900,308B2公开了作为潜在抗病毒化合物的修饰核苷5’-O-三磷酸酯的固相合成，而美国专利7,285,658、7,598,230和7,807,653公开了在糖、核碱基和三磷酸酯部分中具有修饰的核苷三磷酸酯类似物。

WO96/40159描述了用于生产加帽的RNA或RNA类似物分子的方法，其中将RNA或RNA类似物寡核苷酸与亚磷酸化剂（如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮或其环取代的衍生物）反应。将所得到的中间体与磷酸酯或焦磷酸酯或其氧化的或水解的盐反应。通过与激活的m⁷G三-、二-或单磷酸酯或类似物反应，将二-或三磷酸化RNA或RNA类似物加帽。

WO2009/060281描述了含有修饰的寡磷酸酯部分的免疫刺激寡核糖核苷酸类似物和用于制备这些化合物的方法。该方法包括在固体支持物上合成寡核苷酸，在合适的溶剂中，并且在碱的存在下，在寡核苷酸的5’-端，将核苷酸与亚磷酸化剂（如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮）反应，将亚磷酸化的寡核苷酸与焦磷酸酯或焦磷酸酯类似物反应，用氧化剂氧化寡核苷酸，并且将寡核苷酸去保护，以产生三磷酸酯-或三磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸。

WO96/40159中使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳只可用于小规模分离。用于较长寡核糖核苷的5’-单-、二-、三磷酸化产品的离子交换色谱的分辨力受到限制。所需的变性条件使得分离是个冗长乏味的任务（Sproat，1999；Zlatev，2010；WO2009/060281），此外，产品通常受到正-1、正-2序列及其单-和二磷酸酯的污染，导致纯度不足。已知对RIG-I配体的精确末端结构的敏感性，这些纯化方法对药物应用是次最佳的。

双重靶向策略（siRNA和RIG配体）需要与纯化方法无关的通用序列。

发明概述

大规模生产用于潜在临床使用的5’-O-三磷酸化寡核苷酸及其类似物是高度理想的，并且方便的制备方法也是非常需要的。在本申请中，显示了用捕获标记物（例如，癸胺）可以将固相结合的全保护寡核苷酸的5’-O-环三磷酸酯中间体（参见图1）的环打开，产生对RNA的去保护稳定的P_γ标记的物质。标记物的性质使得捕获标记的三磷酸酯物质特异性停留在捕获标记物特异性试剂上。如果需要，可以按序除去标记物。该方法可以延伸至包括三磷酸酯部分的类似物，例如，含有替代氧原子的例如β,γ-亚甲基、氟代亚甲基、二氟亚甲基和亚氨基的类似物。

捕获标记方法的优势是所需物质的简单纯化和提高的回收，例如，在室温下，通过RP-HPLC或亲和性色谱，任选地紧接着在合适的条件下捕获标记物的切割。

优选实施方案的详述

本发明描述了含有捕获标记物的三磷酸寡核苷酸的合成和纯化，包括其类似物。最广泛使用的用于标准5’-OH寡核苷酸的HPLC纯化的方法是三苯甲基-ON寡核苷酸的反相色谱。

本发明中所述的方法提供了实际的解决方法，对于5’-三磷酸化寡核苷酸具有相似的功效。

因此，本发明的主题是制备式（I）的寡核苷酸的方法，

其中V₁、V₃和V₅在每种情况中独立地选自O、S和Se；