[发明专利]检测治疗性外来体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医学领域。

背景技术

外来体一度被认为是细胞的“垃圾袋”，用来丢弃不需要的蛋白质¹。然而，外来体越来越多地被认为具有重要的生理功能，尤其是在细胞通讯中。

外来体是许多细胞类型都有分泌的50-100ηm的双脂质膜泡²。它们属于一类叫做微粒的分泌的细胞产物，其广泛囊括了所有分泌的膜泡。除了外来体，微粒还包括微泡（100-1000ηm）、核外粒体（50-200ηm）、膜颗粒（50-80ηm）、外来体状囊泡（20-50ηm）和凋亡囊泡（50-500ηm）。这些不同类别的微粒的主要区别参数是它们的大小，其中有最明确定义的类别是外来体。

外来体在蔗糖中的密度为1.10至1.19克/毫升，在100,000g沉淀，具有富含胆固醇的脂质膜，其含有鞘磷脂、神经酰胺、脂筏和暴露的磷脂酰丝氨酸。外来体的生物合成是一个复杂的过程，涉及到通过生物合成和内吞途径的复杂的细胞内膜运输和物质分拣（cargo sorting）。证实这种复杂生物合成的证据就是外来体的明显特征是拥有内质网和核内体的标识，例如Alix、Tsg101、Rab蛋白等等。外来体在通过多泡体（MVBs）与质膜融合而释放之前存储在多泡体内。

外来体被发现调节细胞间通讯，特别是在免疫或肿细胞中^3-8。最近，当本发明人公布了人ESC起源的MSC的外来体把心肌缺血再灌注（MI/R）受伤小鼠模型中的梗死面积减少约50％时，延伸此项功能到包括组织修复^9，10。这些外来体是使用HPLC上的尺寸排阻而纯化为直径约50-100ηm均匀大小的微粒，它们同时携带蛋白质和RNA载荷^9,11,12。

然而，MSC外来体的这种心脏保护作用的机制尚不确定。一部分原因可能是由于本发明人缺乏对外来体的一般生物效能的理解。尽管进行了大量针对来自各种细胞类型和生物液体的外来体的蛋白质组学和RNA概况的分析，外来体的蛋白质和RNA的生物效能在很大程度上仍然未被调查。截至目前，大多数生物效能的研究还局限在免疫细胞对外来体所作出的免疫反应上，特别是树突细胞²，但这些生物反应的分子或生化基础还没有被阐明。

发明内容

为了解决这个缺陷，本发明人对HPLC纯化的外来体进行了全面的蛋白组学分析来首先确定存在于这些外来体中的蛋白，然后使用这些蛋白质来预测外来体内生物活性或潜能的类型。这继而通过生化或细胞测定而得以证实。

总共检测到了866个独特的基因产物，它们可以根据功能分成32个过度代表的生物过程，这表明外来体有潜力发挥广谱的生物化学或细胞作用。为了评估这种潜力，本发明人选择了这些蛋白，对于这些蛋白，可以评估其生化和/或细胞活动的测定是可以获得的且该测定的总和可以证实外来体广谱的生物化学和细胞潜力，并提供对MSC外来体的心脏保护性质的候选分子机理。

这里考察的蛋白质包括分解葡萄糖以生成ATP和NADH的糖酵解酶，增加糖酵解的PFKB3，水解AMP为能够通过腺苷受体激活信号级联的腺苷的CD73，抑制膜攻击复合物（MAC）形成的CD59，和蛋白酶体20S。

根据本发明的第一方面，本发明人提供了一种用于检测治疗性外来体的方法。该方法可以包括检测外来体活性。该方法可以包括免疫调节活性。它可以包括补体抑制活性。它可以包括蛋白酶体活性。它可以包括糖酵解酶活性。它可以包括抗氧化活性。它可以包括细胞外基质（ECM）修饰活性。它可以包括NT5E（CD73）外生-5'-外核苷酸酶活性。它可能包括离子稳态活性。它可以包括分子伴侣活性。它可包括上述的任何一个或多个活性。

活性可以包括免疫调节活性。免疫调节活性可以通过检测表D10中列出的蛋白质的活性来检测。

活性可以包括补体抑制活性。补体抑制活性可以通过检测表D1中列出的蛋白质的活性来检测。

该活性可以包括蛋白酶体活性。蛋白酶体活性可以通过检测表D2中列出的一个或多个，优选全部蛋白质的活性来检测。

该活性可以包括糖酵解酶活性。糖酵解酶活性可以通过检测表D3中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。

该活性可以包括抗氧化活性。抗氧化活性可以通过检测表D4中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。

该活性可以包括细胞外基质（ECM）修饰活性。细胞外基质（ECM）修饰活性可以通过检测表D5中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。