[发明专利]用于载物递送进入细胞的系统

说明书

技术领域

本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物（cargo）递送的系统，该系统包含至少一种组分A，其共价连接至细胞穿透肽B和/或肽或非肽构建体C。所述递送系统NickFect涉及与载物非共价或共价复合（络合）的化学修饰的新的细胞穿透肽（CPP）用于有效的细胞递送。更精确地，本发明涉及包含无毒性的肽递送载体的建构物（构建体），其具有增加的稳定性且更有效地从胞内溶酶体逃脱并且其能够与载物形成稳定的复合物（络合物），其在血清的存在下保持完整。

本发明涉及一种递送系统，其具有所形成的纳米颗粒的整体负电荷，用于寡核苷酸递送。

本发明还涉及一种递送系统，其包含分支的CPP，其中脂肪酸修饰的TP10或它的部分通过赖氨酸或它们的类似物的α、β、γ、ε-氨基连接至两亲性肽和/或α-螺旋肽或肽片段。

此外，本发明涉及用于体外或体内将载物（RNA、DNA、药物、质粒、小环（minicircles）等）递送进入靶细胞的细胞质或细胞核的方法。本发明还涉及该系统在疾病的诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、包含上述系统的组合物特别是药物组合物、以该系统覆盖的材料以及具有进入材料的递送系统的材料。最后还涉及新的细胞穿透肽。

背景技术

疏水性细胞膜是封闭细胞内容物的脂双层。它的功能是作为屏障：通常，仅小的和/或疏水性分子可以穿过，并且防止其它大分子如裸露DNA、RNA或蛋白质进入细胞内部。虽然在过去的十年中设计了几种策略来解决此问题，但不能穿过质膜仍然是成就目前的药物研究和开发（R&D）要克服的主要障碍之一。

在过去的40年中，已开发了若干种目的在于调节基因表达的基于寡核苷酸（ON）的方法。除了其它因素以外，这类方法的效率还取决于ON有效摄取进入细胞以及随后的内体逃逸。用于基因调节的其它最基本的方法涉及使用细菌载体来表达感兴趣的基因。除了评价不同基因的功能方面以外，极具吸引力的策略是在临床环境中利用，即基因治疗。最初考虑基因治疗用于遗传性基因疾病的矫正治疗，例如，通过剪接-校正寡核苷酸。然而，在过去的15年中，用于癌症疾病的实验性基因治疗已成为最常见的应用，虽然也已经研究了其它获得性疾病[1]。

已经出现利用较短ON序列来干扰基因表达的其它通用策略。最近已严格地开发了基于双链RNA分子的、长度为20-25个核苷酸的干扰RNA（siRNA）的反义方法，将其用于进行基因沉默或剪接校正ON（SCO），并用于操作剪接模式[2,3]。虽然是用于调节基因表达的有效生物分子，但它们的亲水性本性和大小（在大小超过1MDa的质粒的情况下）会阻止细胞内化。

因此，为了促进目前的基因治疗，需要各种细胞递送系统来将不同分子转运进入细胞，但它们的大多数具有一些缺点，如高细胞毒性、固有的免疫原性、低转染效率等（表1）。

表1：递送载体

因此，细胞穿透肽具有作为体外和体内递送载体的巨大潜力和希望，因此它们可以用于研究和医学领域。细胞穿透肽（CPP），也称作蛋白转导结构域（PTD）是一类肽，在过去的几十年中，作为用于递送各种各样的载物的无毒性载体其已引起广泛关注。这些肽通常长度小于30个氨基酸（aa）并具有净正电荷和/或两亲性并且在体外和体内均能递送有效载荷穿过细胞膜[5]。今天有数百种已知的CPP。为了促进胞内递送，应该以共价或非共价方式将CPP与载物（寡核苷酸、质粒、小环等）连接。肽与ON或任何其它生物分子的共价连接是费力的程序，并且通常需要高浓度的肽连接体以获得显著的生物学响应。在非共价复合物的情况下，有效浓度是在纳摩尔范围内，并且可以通过在水中将肽和生物分子溶液混合在一起持续1小时来实现非共价复合物的形成。

发明内容

本发明提供了一种用于细胞内载物递送的系统，该系统包含一系列新的细胞穿透肽，其克服了非共价基因递送、低的和非均匀递送以及毒性的缺点。

附图说明

图1A.修饰的荧光素酶基因的前体mRNA（Pre-mRNA）。将来自在核苷酸705处携带点突变的B-球蛋白基因的内含子2插入荧光素酶基因。使用SCO阻滞此位点将剪接重定向至功能性mRNA。图1B、图1C.NickFect递送系统的一般示意性结构，其中实线表示共价结合而虚线则是非共价结合。

图2.在使用磷酸化CPP（NF1、NF5）或硬脂基-TP10和与200nM SCO复合（络合）的Lipofectamine2000处理以后的剪接校正。