[发明专利]利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序

说明书

技术领域

本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。

背景技术

由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。

特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。

专利文献1：日本特开2005-098876

专利文献2：日本特开2008-292371

专利文献3：日本特开2009-281831

专利文献4：日本专利第4023523号

专利文献5：国际公开2008-080417

专利文献6：日本特开2007-20565

专利文献7：日本特开2008-116440

专利文献8：日本特开平4-337446号公报

非专利文献1：金城政孝,蛋白质核酸酶Vol.44,No.9,1431-1438页1999年

非专利文献2：F.J.Meyer-Alms,荧光相关谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy),R.Rigler编,Springer,柏林,2000年,204-224页

非专利文献3：加藤则子及其他4名,遗传医学,Vol.6,No.2,271-277页