[发明专利]用于从疫苗离析和量化抗原的方法

说明书

相关申请

本申请要求2011年4月21日提交的序列号61/477,835的美国临时专利申请的权益，该临时申请以引用的方式整体并入本文。

领域

本公开通常涉及疫苗领域及用于在没有已知标准品的情况下离析和测量疫苗中的抗原含量的方法。

背景

流感病毒基于其核蛋白抗原和基质蛋白抗原之间的抗原性差异通常分为三类：A、B和C。取决于两种主要病毒表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性质，流感病毒进一步分为亚型。HA和NA均携带抗原表位。产生针对HA和NA的抗体与抵抗人类和动物中的感染和/或疾病相关联。针对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量来决定。因此，A型和B型流感病毒的主要的抗原决定簇是HA而对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量即抗原含量来决定。

迄今为止，抗原含量用世界卫生组织合作中心(以下称为“WHO”)提供的国际标准品来测量，其用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。然而，通常，当标准品不可用时，例如当病毒抗原的不同季节菌株存在抗原性差异(即较低同源性)或当存在病毒的大流行爆发而对于其尚无可用标准品时，疫苗由疫苗制造商制备。

这种大流行病爆发发生在2009年4月，当墨西哥、美国和几个其它国家中A型流感/加利福尼亚/07/2009 H1N1大流行病爆发时，组合来自人类、猪和禽流感的基因的新型流感菌株进化，最初称为“猪流感”。在此特定的情况下，在WHO具有用于H1抗原的可用标准品之前，需要疫苗。在2009年9月，美国食品和药品管理局批准了针对2009年H1N1流感病毒的四种疫苗。然而在开发这些疫苗的时候，仍然没有可用的WHO标准品来量化新疫苗中的HA。

数十年来，已经使用具有由世界卫生组织(WHO)合作中心提供的国际标准品的单向辐射免疫扩散(SRID或SRD)对流感疫苗的HA含量进行了测定。这些国际标准用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。在SRID中，流感病毒颗粒被去污剂破坏，并且被呈递使其在载有抗体的琼脂糖凝胶中在室温下免疫扩散三天。在凝胶染色时，测量抗原-抗体复合物的沉淀区域的直径，并且通过使用用具有已知HA含量的这种亚型的整个病毒参考批次获得的校准曲线，计算某亚型的病毒制剂的抗原含量。然而，SRID是费力且低通量的测定法。此外，特别对于未经纯化的(过程中的)流感病毒，灵敏度、准确度和精确度相对较低。

Kapteyn等(Vaccine 24:3137-44,2006；“Kapteyn”)公开了用于量化流感病毒培养中的HA以及用于鉴定来自三价疫苗中的单个流感菌株的HA的RP-HPLC测定法。然而，Kapteyn的方法不在没有标准品的情况下量化HA。另外，Kapteyn使用去污剂溶解抗原和烷基化以防止具有活性巯基基团的蛋白质重新结合并形成复合物。实际上，在Kapteyn的方法中，HA通过使用强去污剂溶解膜而被完全离析。Kapteyn的方法也没有被描述适于量化来自福尔马林灭活的流感菌株的HA。

因此，迄今为止本领域没有公开用于准确地和有效地测定粗制或纯化HA样品中的HA抗原浓度的方法，特别是在不用去污剂或烷基化试剂处理的样品中以及在缺少由WHO合作中心提供的HA蛋白标准品下。显然，在可从WHO合作中心得到抗原标准品之前，在本领域中非常需要用于在疫苗制造中可靠离析和量化包括病毒抗原诸如HA抗原的抗原的稳健、准确和快速的方法。下面的公开描述了此类方法的详情。

概述

开发本文描述的方法以在缺乏可用抗原标准品的情况下提供测量疫苗中的抗原含量的装置。因此，本发明解决本领域中涉及在不需要国际标准品的情况下、在疫苗开发和制造过程期间快速和准确量化疫苗中的抗原浓度的一个或多个需要。因此，本文提供的方法允许疫苗制造商在不等待WHO开发和提供标准品的情况下更快地生产疫苗，该疫苗可以被传递给公众。

更具体地说，本发明在不使用标准品的情况下提供离析和准确量化疫苗抗原的快速和稳健方法，其是准确且可重复的。本公开适于用于各种抗原，由此在迄今为止疫苗制造的领域中提供改进方法。

本发明提供了用于从疫苗组合物离析抗原的方法，该方法包括以下步骤：(a)在没有去污剂和没有烷基化试剂的情况下溶解疫苗组合物中的抗原；和(b)通过分级分离离析抗原或抗原亚型。