[发明专利]用于无脉络膜的基因疗法的AAV载体

说明书

发明领域

本发明涉及无脉络膜的治疗或预防的基因疗法。

发明背景

无脉络膜是罕见的眼的脉络膜、视网膜色素上皮和感光器的X连锁渐进变性。受扰男性中的典型自然史是青少年时期开始夜盲症，然后在20多岁和30多岁期间渐进地丧失周边视觉，导致在40多岁完全失明。女性携带者具有轻的症状，大多数患有显著的夜盲症，但可偶尔具有更严重的表型。

该疾病由REP1基因（Rab护卫蛋白1）中的突变引起，该基因位于X染色体21q区。在身体的大多数细胞中，REP2蛋白——与REP175%同源——补偿REP1缺乏。然而，在眼中，由于尚不清楚的原因，REP2不能补偿REP1缺乏。因此在眼中REP多肽活性不足以保持靶蛋白（Rab GTP酶）的正常异戊烯化——导致细胞功能障碍和最终死亡，主要影响外部视网膜和脉络膜。

不存在针对无脉络膜的治疗，并且缺少评价治疗策略的模型。存在提供这样的疗法的需要。

发明概述

本发明涉及载体，其可用于无脉络膜的基因疗法，和利用载体预防或治疗该疾病的方法。本发明还涉及载体在预防或治疗无脉络膜的方法中的应用。

本发明的载体是病毒载体，具体地基于腺相关病毒（AAV）的基因组。载体包括编码REP1或其变体的序列，因此考虑在靶细胞中表达REP1功能。本发明的方法和应用特别涉及通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将载体施用给患者以治疗或预防无脉络膜。

相应地，本发明提供载体，其包含腺相关病毒（AAV）基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。本发明进一步提供在需要其的患者中治疗或预防无脉络膜的方法，包括将治疗有效量的根据在前权利要求中任一项的载体通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射施用给所述患者，和由此在所述患者中治疗或预防无脉络膜。本发明另外提供通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将所述载体施用给患者的本发明的载体在治疗或预防无脉络膜的方法中的应用。

附图简述

图1显示AAV.REP1（AAV-CAG-REP1）载体可有效地转导从患有无脉络膜（Chm）的患者分离的人成纤维细胞。人REP1蛋白（hREP1）表达的相对水平通过蛋白质印迹来比较，允许通过比较不同浓度细胞裂解物中hREP1的量进行AAV2.REP1载体活性定量。关于标记，CAG是具有CMV增强子启动子序列的鸡β肌动蛋白——在各种出版物和该文件的部分中可互换地称作‘CBA’。

左侧的图显示REP1的蛋白质印迹（上面的图）和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹（下面的图）。泳道1：40μg来自对照野生型（WT）成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道3-6：40、20、10和5μg来自用AAV2.REP1载体转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道7：人REP1重组蛋白。由于5μg裂解物hREP1带具有与40μg WT成纤维细胞裂解物相似的密度，所以用AAV2.REP1载体获得的hREP1水平可达到在这些条件下正常的野生型水平的至少8倍（40/5）。

作为该试验中启动子和其它非REP1序列的阳性对照，还显示来自表达绿色荧光蛋白（GFP）代替REP1的对照AAV载体（AAV-CAG-GFP）的结果。

右侧的图显示GFP的蛋白质印迹（上面的图）和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹（下面的图）。泳道1：40μg来自野生型（WT）成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自用AAV2.GFP载体（AAV-CAG-REP1）转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。显示的高水平GFP证实该载体表达盒在转导缺乏REP1活性的人细胞中的有效性，其将是患有无脉络膜的患者中的情况。