[发明专利]发光聚合物循环扩增

说明书

技术领域

本发明涉及一种在液体试样中利用一个具有小表面积的探针和一个具有多个结合分子和多个荧光或化学发光法标记的支化聚合物以探测被分析物的方法。这个方法的敏感性是通过多次循环结合反应和扩增反应来提高的。

背景技术

在许多免疫分析应用中需要发展高灵敏度的测定方法。发光染料，发射荧光或化学发光信号，提供了若干实用性的优点，例如：稳定性，低成本，适合于标记步骤和最小限度的受生物试样或固相底物干扰的光谱性质。与其他测定方法相比，荧光染料法有一个缺点，特别是ELISA,其酶活力扩增了与免疫复合物结构相关的可测信号的总量。

芳基磺酸酯花青荧光染料被描述于Mujumdar等(1993)Bioconjugate Chemistry，4：105-111；Southwick等(1990)Cytometry，11：418-430；和美国专利号5,268,486。每一篇参考文献都描述了Cy5，并且其可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的Biological Detection Systems公司买到，商品名为FLUOROLINK^TMCy5^TM。该芳基磺酸酯花青荧光染料具有高消光系数(通常为130,000升/摩尔至250,000升/摩尔)，优良的量子产率，在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长范围以外(500纳米至750纳米)的荧光发射谱，优良的溶解性，以及低非特异性结合特性。

尽管有这些优异性能，芳基磺酸酯花青荧光染料也存在某些限制。特别是，这些染料的斯托克斯频移相对较窄，其导致该染料的激发和发射谱之间的明显重叠。当这些染料分子在受激发时彼此位置接近时，该激发和发射谱的重叠可以引起荧光的自熄灭。这种自熄灭限制了可以结合至单个抗体分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的数目。在示范性的芳基磺酸酯花青荧光染料Cy5的情况下，斯托克斯频移是17纳米(其为650纳米的激发波长和667纳米的发射波长之差)。当两至四个Cy5分子被结合至单个抗体分子时，获得最佳的荧光产率。当超过四个染料分子被结合至单一抗体分子时，该荧光信号输出迅速下降。这种不能结合超过四个染料分子至单一的抗体分子的特性明显限制了使用Cy5-标记的抗体及其它结合物质的免疫分析的灵敏度。

美国公开2001/0312105公开了一个探测系统和荧光免疫分析；该公开的整体以参考方式被合并于此。该公开没有公开通过探针在试剂容器和扩增容器来回地循环得到扩增。

需要有改善的方法，用于通过荧光或化学发光法免疫分析以高灵敏度检测被分析物。该方法应易于由用户操作，并应提供高特异性的信号和最小的背景噪声。

发明内容

本发明涉及用于探测在液体试样中具有高敏感性的被分析物的发光免疫分析方法。该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，将被分析物与在探针梢端的第一抗体结合；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子试剂以结合该试剂和被分析物；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中来洗涤探针梢端；(e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液中含有一聚合物，该聚合物结合有至少5个分子的该结合配对的第二成员和至少25个荧光标记，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第一和第二成员间的免疫复合体，其中该聚合物是分支的，并且其分子量至少为约一百万道尔顿，发光标记的分子质量小于2000道尔顿；(f)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器以洗涤探针梢端；(g)重复步骤(c)至(f)1-10次，以及(g)通过测定在探针梢端的发光信号来探测免疫复合物。

本发明还涉及到一个组合物，包括(a)具有分子量至少一百万道尔顿的支化聚合物，(b)至少5个结合分子，并且(c)至少25个选自三(双吡啶)合钌(II)(ruthenium(II)tris-bipyridine)，鲁米诺，吖啶酯，和氯化血红素的化学发光分子；其中结合分子和化学发光分子被结合到聚合物上。

附图说明

图1显示了用于探测探针传感表面的荧光信号的光学探测系统。

图2显示了用于探测在探针梢端的化学发光信号的电化学发光探测系统。

图3显示了用于检测抗原被分析物的免疫分析形式。Ab：抗体，Ag：抗原，Sa：链霉亲和素，B：生物素，F：荧光标记。

图4显示了在循环扩增中的探针转移。