[发明专利]在受控制的氧饱和度下通过发酵生产L-胱氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过发酵生产L-胱氨酸的方法。

背景技术

L-胱氨酸是通过使两个L-半胱氨酸分子氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着L-胱氨酸可以通过还原又转化成为L-半胱氨酸。

氨基酸L-半胱氨酸在经济上具有重要意义。其例如用作食品添加剂（特别是用于焙烤食品业），用作化妆品中的原料，及用作生产药物活性成分的起始产物（特别是N-乙酰基半胱氨酸和S-羧甲基半胱氨酸）。

L-半胱氨酸在所有有机体中在硫代谢中发挥关键作用，并用于合成蛋白质、谷胱甘肽、生物素、硫辛酸、甲硫氨酸及其他含硫的代谢物。此外，L-半胱氨酸用作生物合成辅酶A的前体。L-半胱氨酸的生物合成已在细菌中，特别是在肠杆菌（Enterobacteria）中深入研究，在Kredich（1996,Biosynthesis of cysteine,pp.514-527.In F.C.Neidhardt,R.Curtiss III,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter,and H.E.Umbarger(ed.),Escherichia coli and Salmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.）中有详细描述。

除了通过从诸如毛发、鬃丝、角、蹄和羽毛的含有角蛋白的材料进行提取或者通过前体的酶致转化进行的生物转化生产L-半胱氨酸的传统方法以外，在一些年前还开发了通过发酵生产L-半胱氨酸的方法。例如US6,218,168B1、US5,972,663A、US2004/0038352A1、CA2386539A1、US2009/0053778A1和US2009/0226984A1详细地描述了关于通过使用微生物进行发酵生产L-半胱氨酸的现有技术。在此使用的细菌宿主有机体除其他以外是棒杆菌属（Corynebacterium）的菌株以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的代表，例如Escherichia coli或Pantoea ananatis。

除了通过突变和选择获得改善的L-半胱氨酸生产性生物的传统过程以外，还对菌株实施针对性的基因修饰，以实现有效的L-半胱氨酸过度生产。

因此通过插入编码具有降低的L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸-O-乙酰基移转酶的cysE等位基因，使半胱氨酸产量升高（US6,218,168B1；Nakamori et al.,1998,Appl.Env.Microbiol.64:1607-1611；Takagi et al.,1999,FEBS Lett.452:323-327）。通过反馈抗性CysE酶，使L-半胱氨酸的直接前体O-乙酰基-L-丝氨酸的形成基本上与细胞中的L-半胱氨酸水平互不影响。

O-乙酰基-L-丝氨酸是由L-丝氨酸和乙酰基-CoA形成的。因此，以足以产生L-半胱氨酸的量提供L-丝氨酸具有重大意义。这可以通过插入编码具有降低的L-丝氨酸反馈抑制能力的3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因而实现。由此使L-丝氨酸的前体3-羟基丙酮酸的形成基本上与细胞中的L-丝氨酸水平互不影响。EP0620853、US2005/0009162A1、US2005/009162A2和EP0931833描述了此类SerA酶的例子。

此外还已知通过将编码诸如色氨酸酶TnaA或胱硫醚-β-裂解酶MalY或MetC的L-半胱氨酸降解酶的基因弱化或消灭，可以提高发酵过程中的L-半胱氨酸产率（EP1571223）。

增加将L-半胱氨酸从细胞运输出的量是另一种提高培养基中的产物产率的可能性。这可以通过所谓的外排基因的过度表达而实现。这些基因编码膜结合型蛋白质，该膜结合型蛋白质促进从细胞输出L-半胱氨酸的过程。用于输出L-半胱氨酸的各种不同的外排基因已有描述（US5,972,663A、US2004/0038352A1、US2005/221453、WO2004/113373）。

从细胞输出L-半胱氨酸至发酵培养基具有多个优点：

1）L-半胱氨酸连续地提取自细胞内反应平衡，结果是该氨基酸在细胞内保持在低水平，因此不存在敏感性酶类受到L-半胱氨酸的反馈抑制：

2）在存在氧的情况下将释放至培养基中的L-半胱氨酸氧化成为二硫化物L-胱氨酸，在培养期间氧被引入培养基中（US5,972,663A）：